SNT 3729.6-2013 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第6部分：苹果成分检测 实时荧光PCR法.pdf

SN/T3729.6-2013OD:光度密度(optical density)5方法提要提取DNA,以DNA为模版，分别采用苹果的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PC的增幅现象，进行食品及饮料中苹果成分的检测鉴定，其中以苹果果肉DNA为阳性对照，以非苹果来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物探针序列引物/探针引物/探针序列(53)扩增片段长度靶基因内参照5端引物CTTGATTTTACCAAAGATGATGA植物核酮糖-1,5-二磷159bp内参照3端引物TTCTTCGCATGTACCCGCAG酸羟化酶/加氧酶基因苹果5端引物GGAATATGAACGAAAGAGCG苹果核糖体苹果3端引物ATCCGTTGCCGAGAGTCGTT103bpITS1-5.8SITS2基因苹果探针FAM-TGCGTCGTCGTCTTCGATAA-TAMAR6.2CTAB提取缓冲液：20g/L CTAB,l.4mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0。6.3CTAB沉淀液：5g/L CTAB,40mmol/L NaCl。6.4三氯甲烷（氯仿）。6.5异丙醇。6.670%乙醇（体积分数）。6.7NaCl溶液(1.2mol/L)。6.810PCR缓冲液：氯化钾100mmol/L,硫酸铵160mmol/L,硫酸镁20mmol/L,Tris-HCI(pH 8.8)200 mmol/L,Triton X-100 1%,BSA 1 mg/mL.6.9氯化镁溶液：2.5mmol/L。6.10dNTP溶液(dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP):各2.5mmol/L。6.11Tag酶(5U/uL)。6.12UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）。7仪器设备7.1实时荧光PCR仪。7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。7.4离心机：离心力12000g。