SNT 5334.8-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第8部分：转基因甜菜.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5334.82020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法第 8 部分：转基因甜菜Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived productsPart 8:Genetically modified sugarbeet2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布SN/T 5334.82020前 言SN/T 53342020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法分为 8 个部分：第 1 部分：通用要求及定义；第 2 部分：转基因大豆；第 3 部分：转基因玉米；第 4 部分：转基因油菜；第 5 部分：转基因棉花；第 6 部分：转基因马铃薯；第 7 部分：转基因苜蓿；第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 53342020 的第 8 部分。本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关检验检疫技术中心。本文件主要起草人：高东微、刘津、付伟、李志勇、李婷、朱水芳、董洁。I1SN/T 5334.82020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 8 部分：转基因甜菜1 范围本文件规定了进、出口甜菜中转基因品系特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。本文件适用于甜菜中转基因 H7-1 品系特异性的成分定量检测。本文件的定量检测低限为 2.8 拷贝/L，定性检测低限为 0.56 拷贝/L。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分通用要求及定义3 术语和定义SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。4 方法原理见 SN/T 5334.1。5 主要设备及试剂5.1 内源基因和外源基因：内标准基因为谷氨酰胺合成酶基因（GS）；外源序列为 H7-1 品系特异性序列外源基因插入位点 5 端跨界序列。转基因甜菜 H7-1 品系特异性基因序列参见附录 A，特异性dPCR 定量检测所用引物探针序列见表 1。表 1 引物和探针序列基因/品系名称序列扩增长度/bp类型GS上游引物（F）GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG118内标准基因下游引物（R）AGTAATTGCTCCATCCTGTTCA探针（P）VIC-TCTACGAAGTTTAAAGTATGTGCCGCTCTC-BHQ1H7-1 品系特异性上游引物（F）GGGATCTGGGTGGCTCTAACT107外源 基因下游引物（R）ACGAATGCTGCTAAATCCTGAG探针（P）FAM-AAGGCGGGAAACGAC-MGBNFQ5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。2SN/T 5334.820206 方法操作步骤6.1 一般性操作步骤一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。6.2 数字 PCR 反应体系按照表 2 配制数字 PCR 的最终反应体系。表 2 数字 PCRa实验反应体系试剂b储备液浓度体积终浓度MasterMix210 L1内标准基因-F10 mol/L0.8 L0.4 mol/L内标准基因-R10 mol/L0.8 L0.4 mol/L内标准基因-P10 mol/L0.4 L0.2 mol/L外源基因-F10 mol/L0.8 L0.4 mol/L外源基因-R10 mol/L0.8 L0.4 mol/L外源基因-P10 mol/L0.4 L0.2 mol/LDNA 模板2水补水至 20 L a：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。b：最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的数字 PCR 平台产生差异。进行不同数字 PCR平台的体系配置时，需要参照不同平台数字 PCR 仪说明书，并且需要保证表 1 中所列组分的终浓度不变。6.3 数字 PCR 反应程序按照表 3 的程序进行数字 PCR 扩增。表 3 数字 PCR 反应程序反应温度反应时间循环数热启动a95 5 min1热循环（扩增）b94 15 s4960 1 min a：根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增）步骤。b：根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，本后处理步骤按照不同数字 PCR 平台说明书进行。7 结果判定与表述结果计算和判定见 SN/T 5334.1。检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明该样品未检出甜菜内标准 GS 基因，表述为“该样品未检出甜菜成分”；3SN/T 5334.82020 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说明该样品检出甜菜内标准 GS 基因，但未检出品系特异性序列，表述为“该样品未检出转基因甜菜 XXX 品系成分”；检测结果中，内标准基因与外源基因均符合数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该样品转基因甜菜 XXX 品系检测为阳性且满足定量要求，表述为“该样品检出转基因甜菜 XXX 品系成分，含量为%”。8 防污染措施防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。9 样品保存样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。4SN/T 5334.82020附 录 A（资料性附录）转基因甜菜 H7-1 品系特异性基因序列转基因甜菜 H7-1 品系外源基因和甜菜边界序列（来自 US7335816B2）1 CTCGAGCGGC CGCCAGTGTG ATGGATATCT GCAGAATTCG CCCTTATGTT ATCTTTACCA 61 CAGTTTGTTG CTCTGACACA ACCGGTAAAT GCATTGGCCT TTGTTTTTGA TGGCATCAAC121 TTTGGAGCAT CTGATTTTGC ATATTCAGCC TTTTCCATGG TAATTCTTTT ACAAGAATTT181 TCATTCTTTC TTAAGTATAA ACACTTAGCT TGGGACAAAC TTCTGATCCT ATTTCTTAAT241 TTTTGCAGGT GATGGTGGCT GTTATGAGCA TTTTGTGTTT GATGTTTCTT TCTTCTCATT301 ACGGTTTTAT TGGGATCTGG GTGGCTCTAA CTATTTACAT GAGCCTCCGC GCGTTTGCTG361 AAGGCGGGAA ACGACAATCT GATCCCCATC AAGCTTGAGC TCAGGATTTA GCAGCATTCC421 AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC ATATCACTTT ATTCAAATTG GTATCGCCAA481 AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT TTGTAAGGAA GAATTCTCAG TCCAAAGCCT 注：带下划线部分为甜菜基因组序列，阴影部分分别为上下游引物序列，带方框部分为探针序列，扩增产物片段107 bp。中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 8801230 1/16 印张 0.5 字数 14 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1000书号：000000 定价 14.00 元转基因植物产品的数字PCR检测方法第8部分：转基因甜菜行 业 标 准SN/T 5334.82020*网址 5334.82020