SNT 5203-2020 鱼类物种鉴定 基因条形码的检测技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52032020中华人民共和国海关总署发 布ICS 65.150CCS C 502020-12-30 发布2021-07-01 实施鱼类物种鉴定基因条形码的检测技术规范Identification of fish species Technical specification based on DNA barcodingISN/T 52032020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关、深圳华大海洋研究院、深圳市农产品质量安全检验检测中心。本文件主要起草人：郑晓聪、王敏、温智清、阚式绂、刘荭、石琼、何俊强、黄玉、于力、王津津、刘莹、贾鹏、史秀杰、兰文升、秦智锋。1SN/T 52032020鱼类物种鉴定基因条形码的检测技术规范1范围本标文件定了鱼类基因条形码鉴定中的样品处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。本文件适用于对自然环境种化产生的野生型鱼类或其残存的组织进行物种鉴定,不适合杂交选育的品种。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1基因条形码DNA barcoding可用于物种鉴定的具有生物物种序列特征的 DNA 片段，本标准中专指鱼类线粒体基因组中 COI基因 658 bp 的标准片段。3.2基因条形码鉴定技术DNA barcoding identification technique一种利用基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.3序列相似度similarity of the sequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。3.4FASTA 格式FASTA format生物信息学术语，又称 Pearson 格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用 ATCG 表示，序列中不能出现回车等字符。示例：GTGTGTGGGTATGATTCTAAACTGACAAATCGCGCCTATTTATACTTTTTCCCCGGGGTTTAAATTCCTTGGCCCCCATGTGGTTTCTTTAATTTTAGATTGTGGAACCCATTTTCTTAATCCGTAATCG2SN/T 520320204缩略语下列缩略语适用于本文件。BOLD：生物条形码数据系统（barcoding of life datasystem）。5试剂和材料5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2醋酸铵，分析纯。5.3乙醇，分析纯。5.4异丙醇，分析纯。5.5蛋白酶 K，分析纯。5.6高保真 DNA 聚合酶、dNTPs（含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、MgSO4、PCR 缓冲液（不含 Mg2+）和溴酚蓝等试剂，可选用专业试剂公司提供的商品化试剂。5.7引物：用去离子水将每条引物配制成 100 mol/L 储存液，置-20 以下冻存；使用时取适量配制成 10 mol/L 工作液，避免多次冻融。序列见表 1。表 1引物和序列引物名称5-3备注上游引物FishF2t1TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC其中下划线部分为通用测序引物 M13F（-20）VF2t1TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC下游引物FishR2t1CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA其中下划线部分为通用测序引物 M13R（-27）FR1dt1CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA扩增线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基（CO）基因约 700 bp 片段。5.8标准分子量：推荐使用 100 bp DNA marker。5.9琼脂糖，分析纯。6器材与设备台式离心机、各量程可调移液器、可调式恒温浴、微量核酸蛋白测定仪、超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。7取样样品包括活鱼、鱼卵、鲜冻的肉块、单一鱼类制作的肉糜等。宜取鲜活的组织，成鱼优先选取肌肉组织（心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用），鱼卵取卵膜。如需非致死性取样，剪取部分鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块 3 mm35 mm3的肌肉块即可。采集的组织置于冰上低温保存备用，如需长期保存，应置于-20 冷冻或置于 75%乙醇中固定 保存。3SN/T 520320208实验步骤8.1设立对照设置空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含鱼类成分的样品作阳性对照，用已知不含鱼类成分的样品作阴性对照，用等体积的去离子水代替模板 DNA 作空白对照。8.2DNA 提取取 20 mg 样品组织剪碎置于洁净 1.5 mL 离心管中，加入 600 L 裂解液（见附录 A 中 A.1）和 20 L 蛋白酶 K 溶液（见附录 A 中 A.2），混匀，于 56 水浴 1 h3 h，期间不时轻微振动混匀；待组织消化完全，冷却至室温，加入 200 L 醋酸铵溶液（见附录 A 中 A.3），混匀，冰上放置或 4 冷却 5 min10 min，使蛋白质盐析出来；于 4，12 000 g 离心 10 min，将上清液转移至另一洁净的 1.5 mL 离心管中，于 4，12 000 g 离心 10 min，取上清液至另一个洁净 1.5 mL 离心管中，加等体积异丙醇，轻轻摇匀，4 放置 15 min；4，12 000 g 离心 10 min 沉淀 DNA；弃上清，加 1 mL 75%乙醇，轻轻混匀，于 4，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，晾干；干燥后加入 50 L 去离子水溶解；DNA 提取液应置于冰上备用，若需长期保存应置于-20 保存。也可采用经验证可靠的 DNA 提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书使用。8.3DNA 浓度和纯度的测定吸取 DNA 提取液 2 L，以去离子水作为空白对照，使用 NanoDrop 微量核酸蛋白测定仪测定 DNA 模板的质量浓度及 A260/A280。DNA 的质量浓度根据式（1）计算：DNA 的质量浓度=A26050 稀释倍数（ng/L）（1）提取的 DNA 浓度要求大于等于 5 ng/L，A260/A280 的比值在 1.7 1.9 之间。8.4PCR 扩增在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表 2PCR 反应体系组分加样量/L含量/浓度10PCR 缓冲液（不含 Mg2+）51MgCl2（25 mmol/L）52.5 mmol/LdNTPs（10 mmol/L each）10.2 mmol/LFishF2t1（10 mol/L）0.50.1 mol/LVF2t1（10 mol/L）0.50.1 mol/LFishR2t1（10 mol/L）0.50.1 mol/LFR1dt1（10 mol/L）0.50.1 mol/L高保真 DNA 聚合酶（5 U/L）0.50.05 U/l模板/对照150 ng 500 ng去离子水35.5加至 50 L将已加样的 PCR 反应管短暂离心后放入 PCR 仪，扩增反应条件设定：94 预变性 2 min；94 变性 30 s,50 退火 30 s,72 延伸 45 s,30 个循环；72 7 min；4 保存。4SN/T 520320208.5琼脂糖电泳用新鲜配制的 1TAE 电泳缓冲液（见附录 A 中 A.4）配制含 1 g/mL 溴化乙锭（见附录 A 中 A.5）的 2%琼脂糖凝胶。取适量扩增产物和溴酚蓝指示剂按比例混匀后进行电泳检测，设 DNA Marker 同步电泳；采用 5 V/cm8 V/cm，电泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录结果。8.6电泳结果当阳性对照扩增片段大小为 700 bp、阴性对照和空白对照没有扩增片段时，结果成立。此时，若待测样品出现 700 bp 扩增片段则判断该样品 PCR 扩增结果阳性，无扩增片段或者片段大小不符则判断为 PCR 扩增结果阴性（参见附录 B）。8.7序列测定将 PCR 扩增结果阳性产物进行序列测定，测序引物使用通用引物 M13F（-20）和 M13R（-27）。需要时可先进行 PCR 产物的纯化或克隆（参见附录 C）。8.8序列有效性分析通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列（见附录 D 中 D.1）且长度大于 500 bp 为有效序列。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段后应能得到一个具有完整开放阅读框的拼接序列，并可翻译成一条完整的蛋白质序列；否则序列仅供参考（见附录 D 中 D.2）。8.9序列比对鉴定与 BOLD 系统的序列进行比对，具体操作按照附录 E 进行。9结果判断9.1根据序列的相似度判定鱼类的种类，相似度最高且大于 98.0者，可判定为同一种类。9.2若相似度大于 98.0时系统给出两个或以上的物种，需参考形态学特征进行综合判断。9.3序列相似度小于等于 98.0者，不能进行种类的判断。5SN/T 52032020附录A（规范性）试 剂 配 制A.1裂解液1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）1 mL0.5 mol/L EDTA 1 mL0.5 mol/L NaCl 20 mL10%SDS 10 mL 加去离子水定容至 100 mL。A.2蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）将 200 mg 蛋白酶 K 加入 9.5 mL 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶 K 完全溶解。不应涡旋混合。加去离子水定容到 10 mL，然后分装成小份，置于-20 保存。A.3醋酸铵溶液（7.5 mol/L）称取 578.12 g 醋酸铵，加去离子水定容到 1 L。A.41TAE 电泳缓冲液称取 242 g Tris 和 37.2 g Na2EDTA 2H2O 加 800 mL 去离子水充分搅拌溶解后，加入 57.1 mL 醋酸，加去离子水定容至 1 L，即为 50TAE 电泳缓冲液，灭菌后室温保存。使用时用去离子水稀释 50 倍即得 1TAE 电泳缓冲液。A.5溴化乙锭用去离子水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。用时每 100 mL 琼脂糖凝胶中加 10 L。6SN/T 52032020附录B（资料性）PCR 产物凝胶电泳示意图PCR 产物凝胶电泳示意图见图 B.1。说明：M DNA 分子量标准；1 阳性对照；2 阴性对照；3 空白对照；4 目的片段。图 B.1PCR 产物凝胶电泳示意图7SN/T 52032020附录C（资料性）PCR 产物克隆步骤C.1PCR 产物的连接将 DNA 产物纯化后 50 ng 用连接酶连接到 50 ng 载体中。具体操作方法参考连接酶说明书。C.2转化平板的制备向铺好的含有 100 g/mL 相应抗生素的 LB 固体培养基表面加入L 的 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，50 mg/mL）和 20 L 的 X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，20 mg/mL），使用灭菌的涂布棒将其均匀涂布，避光置于 37 放置 1 h3 h，使溶解 X-Gal 的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。C.3转化将感