SNT 5188-2020 迟缓爱德华氏菌病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51882020迟缓爱德华氏菌病检疫技术规范Quarantine protocol for edwardsiellasisICS 65.150CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布2020-12-30 发布2021-07-01 实施ISN/T 51882020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国重庆海关。本文件主要起草人：杨俊、聂福平、李应国、刘生峰、王昱、王国民、李贤良、张雷、肖进文、周庆。1SN/T 51882020迟缓爱德华氏菌病检疫技术规范1 范围本文件规定了迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光 PCR 的检测技术要求。本文件适用于水生动物迟缓爱德华氏菌病检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。E.tarda：迟缓爱德华氏菌。4 迟缓爱德华氏菌病迟缓爱德华菌病，是由迟缓爱德华菌引起的水生动物疾病的统称。鱼类感染后主要出现肠道败血症和肝肾坏死病。迟缓爱德华氏菌病流行病学、临床症状、病理变化等资料参见附录 A。5 病原分离与鉴定5.1 仪器设备显微镜：10 100。5.2 培养基5.2.1 血琼脂:见 B.1。5.2.2 营养琼脂：见 B.2。5.2.3 硫酸亚铁琼脂：见 B.3。5.2.4 半固体琼脂：见 B.4。5.2.5 丙二酸钠培养基：见 B.5。5.2.6 蛋白胨水：见 B.6。5.2.7 葡萄糖蛋白胨培养基：见 B.7。5.2.8 赖氨酸脱羧酶培养基：见 B.8。5.2.9 ONPG 培养基：见 B.9。5.2.10 糖发酵管：见 B.10。2SN/T 518820205.2.11 可使用商业化的培养基。5.3 病料的采集和处理无菌采取适量患病动物肝、肾及病变组织，置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗，匀浆待用。如不能立即进行检验，需将采集或处理的样品置 4 8 条件下保存，且不超过 24 h。5.4 分离培养取样品匀浆，划线接种血琼脂平板，28 1 培养24 h48 h。从中挑取灰白色、圆形、湿润、呈半透明状的单菌落在普通营养琼脂平板上纯化培养。5.5 染色镜检将可疑菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察。迟缓爱德华氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无荚膜，无芽胞，大小约为（0.5 m 1 m）（1 m 3 m）。5.6 生化试验5.6.1 氧化酶试验取白色洁净滤纸蘸取菌落，加 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深;再加 1%-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性者于两分钟内不变色。或以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与前述相同。5.6.2 生化鉴定试验氧化酶试验为阴性的可疑菌按附录 C 进行生化鉴定。6 迟缓爱德华氏菌核酸检测6.1 试剂和材料6.1.1 水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。6.1.2 DNA 提取液40 mmoL/L Tris-HCl，pH8.0 20 mmol/L 乙酸钠，1 mmol/L EDTA，1%SDS。6.1.3 10PCR 缓冲液氯化钾（KCl）:500 mmol/L；Tris HCl（pH 8.3）:100 mmol/L；明胶:0.1%；MgCl2：15 mmol/L。6.1.4 dNTPSdATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2.5 mmol/L。6.1.5 Taq DNA Polymerase（5 U/l）6.1.6 50TAE 缓冲液称取484 g Tris，量取114.2 mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），溶于水中，定容至2 L。分装后高压灭菌备用。3SN/T 518820206.1.7 DNA Marker6.1.8 SYBR Green 核酸染料6.2 仪器和设备6.2.1 PCR 仪。6.2.2 电泳装置。6.2.3 凝胶成像系统。6.2.4 PCR 超净工作台。6.2.5 高速台式离心机（转速 12 000 r/min 以上）。6.2.6 台式离心机（转速 2 000 r/min 以上）。6.2.7 微量可调移液器（2 L、10 L、100 L、1 000 L）。6.2.8 荧光定量 PCR 仪。6.3 模板提取6.3.1 煮沸抽提法取待测样本（增菌培养液或分离菌落菌悬液）1 mL，加到 1.5 mL 离心管中，8 000 r/min 离心4 min，吸弃上清液，加入 50 L DNA 提取液，混匀后沸水浴 5 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液保存于-20 备用，-70 可长期保存。6.3.2 试剂抽提法取待测样本（增菌培养液或分离菌落菌悬液）1 mL，加到 1.5 mL 离心管中，8 000 r/min 离心4 min，吸弃上清，加入 200 L DNA 提取液，充分混匀后，12 000 r/min 离心 10 min。将上清液转移到新离心管中，加入等体积的 Tris 饱和酚，混匀，12 000 r/min 离心 3 min。取水层，加等体积的氯仿，混匀，12 000 r/min 离心 3 min。取出上清用预冷 2 倍体积的无水乙醇沉淀，15 000 r/min 离心 15 min，弃上清液。用 400 L 70的乙醇洗涤 2 次。真空干燥后，用 50 L TE 或超纯水溶解 DNA，-20 冰箱放置备用，-70 可长期保存。6.3.3 试剂盒方法使用等效的商业化细菌 DNA 提取试剂盒，并按其说明提取制备模板 DNA。6.4 聚合酶链式反应（PCR）6.4.1 引物P1:5-CATCGTCACCATTCACAGT-3P2:5-CCTTAATCCCACCCTCATAG-3扩增目的片段为 494 bp。6.4.2 试验对照空白对照以水代替 DNA 模板；阴性对照以非目标菌的 DNA 作为 PCR 反应的模板；阳性对照采用含有检测序列的 DNA（或质粒）作为 PCR 反应的模板。6.4.3 反应体系：10PCR 缓冲液 2.5 L10 mol/L P1 1 L4SN/T 5188202010 mol/L P2 1 LdNTPs 2 LDNA 模板 2 LTaq DNA 聚合酶 0.5 L水 补齐至 25 L也可使用等效的商业化的 Taq 预混酶并按其说明配制反应体系。6.4.4 PCR 反应将配制好的 PCR 管放入 PCR 反应仪内，循环条件设置见表 1。表 1循环条件设置表预变性扩增循环数后延伸94 /5 min94 /30 s52 /30 s72 /30 s3572 /10 min6.4.5 电泳用电泳缓冲液（1TAE）制备 1%2%琼脂糖凝胶（55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 g/mL，也可在电泳后进行染色）。取 5 L 10 L PCR 扩增产物，分别和 2 L 上样缓冲液混合，进行点样，用 DNA Marker 做参照。3 V/cm 5 V/cm 恒压，电泳 20 min 40 min，电泳结果用凝胶成像分析系统记录并保存,也可在 365 nm 波长紫外光下观察电泳结果。6.4.6 质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：无扩增条带。b）阴性对照：无扩增条带c）阳性对照：有同预期大小一致的扩增条带。6.4.7 结果判定如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品 PCR 检验结果为阴性。如待测样品出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品 PCR 检验结果为阳性。对于阳性结果，可回收 PCR 产物测序，将测序结果同参考序列（参见附录 D）比对，也可将测序结果提交 NCBI 网站进行 BLAST 分析。6.5 实时荧光 PCR6.5.1 引物和探针S1：5-TGTTTGAGGTGGTGGATAA-3S2：5-TGTGAATGGTGACGATGA-3T1：5-CACCACATGGTGTTTGAG-3T2：5-CGATGATATCTTTGCAATAACC-3Probe：5-FAM-CTTCGTCAATCGCGTTATCCACC-TAMRA 36.5.2 试验对照空白对照设为以水代替 DNA 模板；阴性对照采用非目标菌的 DNA 作为 PCR 反应的模板；阳性5SN/T 51882020对照采用含有检测序列的 DNA（或质粒）作为 PCR 反应的模板。6.5.3 实时荧光 PCR 反应体系6.5.3.1 SYBR Green 实时荧光 PCR 反应体系10PCR 缓冲液 2.5 L10 mol/L S1 1 L10 mol/L S2 1 LdNTPs 2 LSYBR Green 1 LDNA 模板 1 LTaq DNA 聚合酶 0.5 L水 补齐至 25 L也可使用等效的商业化的 Taq 预混酶并按其说明配制反应体系。6.5.3.2 Taqman 实时荧光 PCR 反应体系10PCR 缓冲液 2.5 L10 mol/L T1 1 L10 mol/L T2 1 LdNTPs 2 L10 mol/L Probe 1 LDNA 模板 1 LTaq DNA 聚合酶 0.5 L水 补齐至 25 L也可使用等效的商业化的实时荧光 PCR 预混液并按其说明配制反应体系。6.5.4 实时荧光 PCR 反应实时荧光 PCR 反应条件随仪器不同略有改变，一般为：预变性：95 /30 s；PCR 循环：95 /5 s，60 /30 s，40 个循环。荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行。6.6 质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40。b）阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40。c）阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于 30。d）如果采用 SYBR Green 实时荧光 PCR 检测，还应对扩增产物进行溶解曲线分析，有扩增的样本其溶解曲线应只有一个峰。6.7 结果判定如 Ct 值小于等于 35，则判定为检验结果阳性。如 Ct 值大于等于 40，则判定为检验结果阴性。如比值大于35小于40，则结果可疑，应重复一次试验，如再次扩增后Ct值仍小40，则判为阳性；如再次扩增后 Ct 值大于 40，则判为阴性。6SN/T 51882020附 录 A（资料性）迟缓爱德华氏菌病概述A.1 流行病学迟缓爱德华菌呈世界性分布，在非洲、美洲和亚洲已经有较多报道。迟缓爱德华菌的易感动物包括贝类、鱼类（海水鱼、淡水鱼）、两栖类（牛蛙）、爬行类（蛇、蜥蜴）、鸟类、哺乳类（猪、马）及人类。患病鱼类及动物尸体、粪便是迟缓爱德华氏菌病主要的传染源。鱼类通过摄食带菌的饵料，或者接触带菌的鱼类而感染。人类主要通过食用带有迟缓爱德华菌的食物而受到感染，有生食习惯的人群感染该菌的可能性较大。A.2 临床症状鱼类感染迟缓爱德华氏菌后表现为运动异常，呈螺旋状游动和浮到水面，色素沉着减少，眼球突出，眼睛浑浊，腹部膨大，鱼鳍和皮肤点状出血，直肠脱出。A.3 病理变化将病鱼解剖，可以发现其腹腔出现水性和血性腹水，肝、脾和肾充血。鱼类患迟缓爱德华氏菌病的组织病理学特征为化脓性、间质性肾炎，化脓性肝炎和脾脏化脓性炎症。肝脏、脾脏和肾脏出现不同程度脓肿，细菌定殖，中性粒细胞和巨噬细胞浸润。迟缓爱德华氏菌感染后的症状和病理变化同嗜水气单胞菌、鳗弧菌以及病鳝假单胞菌都非常相似，因此，应当通过分子生物学或生化方法对疑似病例进行确诊。7SN/T 51882020附 录 B（规范性）培养基配方B.1 血琼脂牛心消化汤（pH7.4 7.6）100 mL琼脂 2 g黄豆粉浸液 5 mL脱纤维羊血（或兔血）5 mL 1