SNT 3640-2013 出口食品中致泻大肠杆菌检测方法 PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3640-2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法PCR法Determination of diarrheagenic escherichia coli in food for export-PCR Method2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T3640-20135.2TE溶液：见附录A中A.1.1。5.310%SDS。5.4蛋白酶K(20mg/mL)。5.5氯化钠溶液(NaCl):5mol/L和0.7mol/L。5.610%CTAB。5.7三氯甲烷。5.8异戊醇。5.9酚。5.10异丙醇。5.1170%乙醇。5.1210PCR缓冲液：见A.1.2。5.1350TAE缓冲液：见A.1.3。6主要仪器和设备6.1紫外分光光度计。6.2PCR仪。6.3电泳装置。6.4离心机（离心转速14800g,730g)。6.5PCR超净工作台。6.6灭菌PCR反应管。6.7凝胶分析成像系统。7操作步骤7.1样品制备、增菌培养和分离7.1.1肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌按照GB/T4789.6中的方法进行。7.1.2肠出血性大肠杆菌O157:H7按照GB/T4789.36中的方法进行。7.2细菌DNA模板的制备对于上述方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1mL,加到1.5mL无菌离心管中。12000g离心1 min;吸弃上清，取沉淀，加567LTE溶液，悬浮，加30L10%SDS和3L蛋白酶K,混匀，37温浴 1 h;加 100 L 5 mol/L NaCl,混匀，加80 L CTAB/NaCl溶液(10%CTAB和0.7 mol/L NaCl),混匀，65温浴10min;加等体积三氯甲烷/异戊醇（体积比为24：1），混匀，12000g离心10min;取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比为25：24：1），混匀，12000g离心10min;取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，12000g离心10min;取沉淀，用70%乙醇清洗2次。干燥，加100LTE溶液溶解，此即为DNA溶液。若不能立即检测，可保存于-20备用。用于阳性对照的菌株应按7.2的步骤同时进行DNA的制备操作。7.3DNA浓度和纯度的测定取5LDNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照式(1)计算获得：C=AN50/1000(1)2