SNT 4848.3-2017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法 第3部分：洋槐.pdf

SN/T 4848.3-2017前言SN/T4848出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法共分为8部分：第1部分：荆条；第2部分：油菜；第3部分：洋槐；第4部分：桉树；第5部分：椴树；第6部分：龙眼；第7部分：荔枝和龙眼；第8部分：紫云英。本部分为SN/T4848的第3部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。本部分主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、黄文胜、韩建勋、张九凯、刘鸣畅、邓婷婷、宗凯。ISN/T4848.3-20176.6蛋白酶K(20mg/mL)。6.7CTAB提取缓冲液：20g/L CTAB,l.4mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl,0.02mol/L Na2 EDTA,pH8.0。6.8CTAB沉淀液：5g/L CTAB,40mmol/L NaCl.6.910PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HC1(pH8.4),200mmol/LKC1,15mmol/L MgCl2。6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5L反应体系包括：1U2U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1PCR buffer、2.5mmol/L4.0mmol/L的Mg2+、0.2U1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs、0.2mmol/L0.4mmol/L dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）。7仪器设备7.1实时荧光PCR仪。7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。7.4离心机：离心力12000g。7.5微量移液器：0.5L10L,10L100L,20L200L,200L1000L。7.6恒温混匀仪。7.7涡旋震荡器。7.8pH计。7.9量筒：容量50mL。7.10烘箱。8检测步骤8.1DNA提取8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取8.1.1.1蜂蜜样品50水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀。8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mL离心管中，加入无菌双蒸水至30mL,涡旋混匀，4000r/min离心l0min,吸出上清(4贮存备用)。8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min,去除上清。8.1.1.4加入600 L CTAB提取缓冲液，置于65恒温混匀仪中温育1h2h,转速为650r/min;12000r/min离心10min。8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中；加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心l0min。8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min。8.1.1.7弃上清，加入350uL1.2mol/L NaCl溶液，充分溶解沉淀。8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，一20放置0.5h1h,12000r/min转速4离心10min15 min8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4离心10min。8.1.1.10弃上清，室温下晾干。加入50L100L双蒸水，溶解沉淀，一20保存。8.1.2蜂蜜上清DNA提取将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL,参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放3