农业部2122号公告-1-2014 转基因动物及其产品成分检测 猪内标准基因定性PCR方法.pdf

农业部2122号公告一1一20147分析步骤7.1抽样静脉采血5mL,采集组织样（肌肉、皮肤等）或动物加工产品，称取1g,保存备用。7.2试样预处理7.2.1血液样品取300uL血样于1.5mL离心管中，加入等体积DNA提取细胞裂解液(5.8)，20L蛋白酶K溶液(5.9),混匀，55水浴消化过夜。7.2.2组织样品和动物加工产品取适量样品在液氨中充分碾磨成粉末，称取0.05g转移至1.5mL离心管中，加人10倍体积DNA提取细胞裂解液，20L蛋白酶K溶液，混匀，55水浴消化过夜。7.3DNA模板制备7.3.1将消化后的血样裂解液或组织裂解液加人等体积的Tis饱和酚(5.10)，缓慢颠倒混匀10min,4，12000g离心10min,将上清液移至新的1.5mL离心管中。7.3.2加入0.5倍体积的Tris-饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇(24：1)，缓慢颠倒混匀10min,4，12000g离心10min,将上清液移至新的1.5mL离心管中。7.3.3加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，缓慢颠倒混匀10min,4，12000g离心10min。7.3.4将上清液吸至1.5mL离心管，加入2倍体积的低温无水乙醇，轻轻颠倒离心管至完全混匀，可见白色絮状沉淀析出。7.3.54下12000g离心5min,加入500L70%乙醇洗涤沉淀，弃去乙醇洗涤液。7.3.6室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入50LTE缓冲液(5.12)溶解DNA沉淀。7.3.7将DNA适当稀释或浓缩，使其OD2值在0.10.8的区间内，测定并记录其在260nm和280nm的吸光度。以一个OD2o值相当于50ng/LDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液OD2/OD0值应在1.72.0，或质量能符合检测要求。7.3.8依据测得的浓度将DNA溶液用TE缓冲液稀释到25g/L,一20保存。注：以上为SDS法提取基因组DNA的操作步骤，亦可使用经验证的适合转基因动物及其产品检测DNA提取和纯化的其他方法，如试剂盒方法等完成DNA模板的制备步骤。7.4PCR反应7.4.1试样PCR反应7.4.1.1每个试样PCR反应设置3次平行。7.4.1.2在PCR反应管中按表1依次加人反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加)。也可采用经验证的、等效的定性PC反应试剂盒配制反应体系。7.4.1.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s后取出PCR管，放入PCR仪中7.4.1.4进行PCR反应。反应程序为：94变性5min;94变性30s,60退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸5min。7.4.1.5反应结束后取出PC反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水10XPCR缓冲液1X2.5L25mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5L3