农业部1861号公告-3-2012 转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法.pdf

农业部1861号公告一3一2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法1范围本标准规定了玉米内标准基因zSSIIb的定性PCR检测方法。本标准适用于转基因植物及其制品中玉米成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样农业部1485号公告一4一2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1ZSSIIb基因zSSIIb gene编码玉米淀粉合酶异构体STS-2的基因。4原理根据zSSIIb基因序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型的荧光扩增曲线，判断样品中是否含玉米成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭(EB),溶解于100ml.水中，避光保存。蕾告澳化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后，冷却至室温，再加水定容至200ml。5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取18.6g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na),加人70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(5.3)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(5.3)调pH至8.0，加水定容至100ml。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.51mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tis)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。农业部1861号公告一3一20125.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(5.5)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1TAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30ml.水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100ml,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚地区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。5.12普通PCR引物：zSSIIb-1F:5-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3aSSIIb-2R:5-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3预期扩增片段大小151bp(参见附录A)。5.13实时荧光PCR引物和探针：zSSIIb-3F:5-CGG TGG ATG CTA AGG CTG ATG-3zSSIIb-4R:5-AAA GGG CCA GGT TCA TTA TCC TC-3zSSIlb-P:5-FAM-TAA GGA GCA CTC GCC GCC GCA TCT G-BHQ1-3预期扩增片段大小88bp(参见附录A)。5.14引物溶液：用TE缓冲液(pI18.0)或水分别将引物稀释到10mol/L。5.15石蜡油。5.16DNA提取试剂盒.5.17定性PCR反应试剂盒。5.18实时荧光PCR反应试剂盒。5.19PCR产物回收试剂盒。6仪器和设备6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0.6.3荧光定量PCR仪。6.4电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.5紫外透射仪。6.6凝胶成像系统或照相系统。6.7重蒸馏水发生器或纯水仪。6.8其他相关仪器设备。7操作步骤7.1抽样按NY/T672和NY/T673的规定执行。2建筑321一标准在相下伐4w,z321.nc