GBT 5009.23-1996 食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的测定方法.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/r 5 0 0 9.2 3-1 9 9 6食品中黄曲霉毒素B i,B 2,G i,G:的测定方法f G 13 5 0 0 9.2 3 8 5Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f a f l a t o x i n s B B Z,G G z i n f o o d s1 主题内容与适用范围 本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素B B,G G:的测定方法。本标准适用于各种食品中黄曲霉毒素B,B z,G G:的测定。在薄层板上的最低检出量:黄曲 霉毒素B G，为0.0 0 4 p g,B i,G 2 为0.0 0 2 p g。本方法的最低检出浓度:黄曲霉毒素B l、G,B,G,为5 p g/k g,B _ G z 为2.5 p g/k g o2 引用标准 G/T 5 0 0 9.2 2 食品中黄曲霉毒素B，的测定方法 第一篇薄层色谱法3 原理 样品经提取、浓缩、薄层分离后，在3 6 5 n m紫外光下，黄曲霉毒素B B:产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G G，产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显示的荧光的 最低检出量来定量。4 试剂4.1 所用试剂同G B/T 5 0 0 9.2 2 中3.1-3.1 3.4.2 次氯酸钠溶液(消毒用):配制方法见G B/T 5 0 0 9.2 2 中3.1 6,4.3 苯 一 乙 醇一 水(4 6+3 5+1 9)展开剂:取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5 m i n,静置过夜。将I:下 层溶液分别置于具塞瓶中保存，上下层交界的溶液弃去不要。若溶液出现混浊，则在8 0 0C 水浴上加热，待清晰后，即停止加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量的下层溶液置小血中，再放于展开槽内将薄层板放入展开槽内，预先饱和1 0 m i n 后展开。4.4 硫酸(1+3).4.5 黄曲霉毒素B B,G G:标准溶液。4.5.1 单 一标准溶液(1 0 p g/m L):准确称取黄曲霉毒素B,G，标准品各1 -1.2 m g，黄曲 霉毒素B、G 标准品各。.5-0.6 m g，用苯一 乙睛混合液作溶剂。配制方法、浓度及纯度的测定参照G B/T 5 0 0 9.2 2干，3.1 4 黄曲霉毒素B B G G:的分子量及用苯一 乙睛作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数见卜 表中华人民共和国卫生部 1 9 9 6 一 0 6-1 9 批准1 9 9 6 一 0 9 一 0 1 实施G B/r 5 0 0 9.2 3-1 9 9 6战曲8毒名称 1 i;I i最大吸收峰波长，n m 3 16 3 4 8 3 53 354摩尔消光系数分子量 3 1 2 31 4 3 2 8 1 3 0800900100200:;452 各标礁使用液:以 F 各标准液均用苯一 乙A N 混合液配制。4.5.2.1 鲜曲霉毒素混合 标准使用液I:每毫升相当于。.2 p g 黄曲霉毒素B G，及。.1 p g 黄曲霉毒索“、(，作定位用4.5.2.2 黄曲霉毒素混合标准使用液u:每毫升相当于0.0 4 p g 黄曲霉毒素B,G，及。0 2 p g 黄曲霉毒索1 3,C:.作最低检出i f t 用。5 仪器H GB,T 5 0 0 9.2 2中 4.1-4.96 分析步骤6.1 取样:同G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.1.6.2 提取:f,fl G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.2.6.3 il!U 定:6.3.1 单向展开法6.3.1.1 薄层板的制备:同G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.1.1,6.3.1.2 点样:l al G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.1.2.滴加式样如下:第 一 点:1 0 砂 黄曲霉毒素混合标准使用液D。第 屯 点:2 0 1 l，样液。第一 点:2 0 川 样液+1 0 I L黄曲霉毒素混合标准使用液I,第四点:2 0 川 _ 样液+1 0 K L 黄曲霉毒素混合标准使用液 工。6.3.1.3 展开与 观察 黄曲霉毒素B;,B 2,G G:的比移值依次排列为B,B z G,G 2 a 在 展开 槽内加1 0 m L无水乙醚，预展1 2 c m，取出挥干，再于另一展开槽内 加1 0 m L丙酮一 三氯甲 烷t 8+9 2),展开1 0 1 2 c m，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。6.11.11 由于样液点上加滴黄曲 霉毒素混合标准使用液I 或I，可使黄曲 霉毒素B B,G G,分别 拼 羊 液中的黄曲霉毒素B B,G G,荧光点重叠。如样液为阴 性，薄层板上的第三点中 黄曲霉毒素Bh、(.、(;依次为0.0 0 0 4,0.0 0 0 2,0.0 0 0 4,0.0 0 0 2 W g，可用作检查在样液内黄曲 霉毒素B 1,B,G G,的展低检出址是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B 1,B,G G,依次为。.0 0 2.0.0 0 1,0.0 0 2,0.0 0 1 V g，主要起定位作用。6.31.3.2 若第二点在与黄曲霉毒素B B:的相应位置上无蓝紫色荧光点;或在与黄曲霉毒素G 1,G z的f l I I w 位W iil 上无黄绿色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B G，含量在5 p g/k g 以下;B _ G 2 含量在2.5 f i g,k g 以;如在 相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。631.4 确证试验:6.3.1.4.1 黄曲霉毒素与三氟乙酸反应产生衍生物，只限于B，和G,;B:和G:与三氟乙酸不起反应!，和G。的衍生物比 移值为B,G,。于薄层板左边依次滴加两个点点:1 0 P I _ 黄曲霉毒素混合标准使用液I。点 2 0 川 样液。第第 1:以上 两点各加三氟乙酸1 小滴盖于其上，反应5 m i n 后，用吹风机吹热风2 m i n，使热风吹到薄层版上 的温度不高于4 0 C。再于薄层板上滴加以下两个点。G B/T 5 0 0 9.2 3-1 9 9 6 第_点:1 0 p 1黄曲霉毒素混合标准使用液 II。第四点:2 0 1,1样液 再展i 似同6.3.1.3)，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B，或G、标准点相同的衍生物，末加三l ut 乙酸的二、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。6.3.1.4.2 黄曲霉毒素B 2 和G 2 的确证试验，可用苯一 乙醇一 水(4 6-1-3 5+1 9)展开，若标准点与样液点出现谊叠.即可确定。6.3.1.4.3 在展开的薄层板上喷以硫酸(1-1-3)，黄曲霉毒素B B 2,G G，都变为黄色荧光。6.3-1.5 稀释定敏:样液中黄曲霉毒素B B,G G,荧光点的荧光强度如各与黄曲霉毒素B B,G,G，标准点的最低检出量(B G，为0.0 0 0 4 p g,B 2,G。为。.0 0 0 2 p g)的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B,G,含垦为5 p g/k g;B,G:含量为2.5 p g/k g。如样液中任何一种黄曲 霉毒素的荧光强度比其最低检出量强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计脚方 法参照G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.1.5 与5.3.1.6 06.3.2 双向展开法6.3.2.1 滴加两点法6.3.2.1.1 点样:取薄层板三块，在距下端3 c m基线上滴加黄曲霉毒素标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘。.8-1 c m处各滴加1 0 p L 黄曲霉毒素混合标准使用液 Q，在距左边缘2.8-3.0 c m处各 滴加2 0 川 样液，然后在第二板的样液点上加滴1 0 p L黄曲霉毒素混合标准使用液II;在第三板上的样液点上加滴 1 0 p L黄曲霉毒素混合标准使用液 工。6.3.2.1.26.3-2.1.3展开:同G B/T 5 0 0 9.2 2中5.3.2.1.2.观察及评定结果:6.3.2 门 3 门在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B B 2,G G 2 标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B(,含量在5 p g/k g 以下;B G:的含量在2.5 p g/k g 以下。6.3.2.1.32 若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第 二 点与 第一 板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素B B,;G G,标准点重叠，如果橄叠，再按 6.3.2.1.3.3 进行所需的确证试验。6.3.2.1.3.3 黄曲霉毒素B,、G,的确证试验:取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.8 -1 c m处各滴加1 0 川 黄曲霉毒素混合标准使用液 II 及1 滴三氟乙酸，距左边缘2.8 -3 c m处，第四板滴加2 0 p l 样液及1 滴三氟乙酸;第五板滴加2 0 p L 样液、1 0 p L黄曲 霉毒素混合标准使用液II 及1 滴三氟乙酸。产生衍生物的步骤及展开方法同G B/T 5 0 0 9.2 2中5.3.2.1，观察样液点是否各产生与其黄曲霉毒素B,或G，标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板n如样液黄曲霉毒素B B 2,G G 2 含量高时，则将样液稀释后按6.3.1.4 作确证试验。稀 释定量与计算参照G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.2.1.5 与5.3.2.1.6,632.2 滴加一点法 同G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.2.2,0 代替黄曲霉毒素 B 标准使用液(0.所不同处是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素混合标准使用液0 4 p g/m L)。稀释定量与计算参照G B/T 5 0 0 9.2 2 中5.3.2.2 与5.3.L 6第二篇微柱筛选法了 原理 样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉熟素被硅镁吸附剂吸附，在3 6 5 n m紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与 黄曲霉毒素的含m 成正G B/T 5 0 0 9.2 3-1 9 9 6比，由于微柱不能分离B B 2,G G,，故结果为黄曲霉毒素的总量。8 试剂8.1 石油醚:沸程6 0-9 0 c 或3 0 6 0 C.8.2 中 性氧化铝:层析用1 0 0 -2 0 0目。8.3 酸性氧化铝:层析用1 0 0 2 0 0目。8.4 无水硫酸钠:过4 0 8 0 目 筛或8 0 1 0。目 筛。8.5 硅镁型吸附剂:层析用1 0 0 2 0 0目。8.6 甲醇水溶液:(5 5+4 5),8.了 展开剂:丙酮一 三氯甲烷(1+9),8.8 脱脂棉:用索氏提取器以二氯甲烷为溶剂提取 2 h，挥干后贮于瓶中保存.。8.9 黄曲霉毒素B、标准液:用苯一 乙睛(9 8+2)配成0.4 p g/m L的贮存液及。.1 leg/ml-的使用液，避光冷藏。注:层析用氧化铝、硅 镁型吸附剂、无水硫酸钠应在1 2 0 C 活化2 h,密塞，贮于干燥器内可保存一周9 仪器紫外光灯:8 1 0 0 W,带有波长 3 6 5 n m滤光片。微柱管:内径。.4 c m，长 1 2 c m的玻璃管，为加液方便上加一段粗管。微柱管架。微量注射器:5 0 m L,分析步骤月，.门了，口月 .。n户nHOJOJO口月.卫1 0.1 提取1 0.1 门粮食、花生及其制品:取粉碎过筛(2。目)样品 2 0.0 0 g 于具塞锥形瓶中，加 1 0 0 m L甲醇水溶液，3 0 n il,石油醚，密塞振摇3 0 m i n,静置片刻，过滤于5 0 m L具塞量筒中，收集5 0 m L甲醇水滤液(注意切勿将石油醚层带入滤液中)，转人分液漏斗中，加5 0 m L硫酸钠溶液(2 0 g/L)稀释，加三氯甲烷1 0 r il l，轻摇2-3 m i n,静置分层，三氯甲 烷层通过装有5 g 无水硫酸钠的小漏