GBT 35520-2017 化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验.pdf

I C S1 3.3 0 0;1 1.1 0 0A8 0中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T3 5 5 2 02 0 1 7化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验C h e m i c a l sE m b r y o t o x i c i t yE m b r y o n i c s t e mc e l l t e s t2 0 1 7-1 2-2 9发布2 0 1 8-0 7-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布前 言 本标准按照G B/T1.12 0 0 9给出的规则起草。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(S A C/T C2 5 1)提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国化工经济技术发展中心、常州进出口工业及消费品安全检测中心、宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人:李海山、陈会明、韩辉、崔媛、王晓兵、刘君峰、陈小青、程艳、艾文超、谢文平。G B/T3 5 5 2 02 0 1 7引 言 小鼠胚胎干细胞(Em b r y o n i cs t e mc e l l s,E S)在不同的培养条件下会分化为不同的胚胎组织。因此,一些研究小组使用小鼠E S细胞进行体外胚胎毒性试验。L a s c h i n s k i等1比较了E S细胞和小鼠纤维母细胞的细胞毒性,以评估致畸物的潜在胚胎毒性。H e u e r等2-3比较了E S细胞的细胞毒性和分化抑制。N e w a l l和B e e d l e s4测定了培养7d后,致畸物对E S细胞的细胞毒性和集落形成能力的影响,这适用于常规测试,因为集落形成这一终点可自动化完成。在所有这些试验中,只有一些胚胎毒性物能够被正确分类。这可能是由于在E S试验中选择2个终点不足以评估胚胎毒性。为克服上述E S细胞试验的限制,S p i e l m a n n等5确定了3个不同的试验终点(半数分化抑制浓度、D 3细胞半数生长抑制浓度和3 T 3细胞半数生长抑制浓度)。根据这些终点可导出3个变量。所得的3个变量作为受试物分为3个体内胚胎毒性等级的依据。这种方法有利于给出胚胎组织与成体组织之间对化合物细胞毒性损伤的敏感性差异。事实上,利用判别分析已将1 6种受试化学品正确归入已知的3种体内胚胎毒性等级5-6。这是第一个不处死妊娠动物而获得体外培养所需胚胎组织的体外胚胎毒性测试。在本标准中为验证研究制定的标准操作程序克服了实验室中E S状态维持的问题,E S细胞通常倾向于自发分化。此外,根据制定的性能标准,欧盟替代方法验证中心(E u r o p e a nC e n t r e f o r t h eV a l i d a t i o no fA l t e r-n a t i v eM e t h o d s,E C VAM)验证研究表明体外数据和体内数据之间具有较好的相关性(准确性7 8%)。据报道,强胚胎毒性化学品的预测性(1 0 0%)极好、精确度(8 1%)良好。据报道,无胚胎毒性物质和胚胎毒性弱的物质的预测性(分别为7 2%和7 0%)和无胚胎毒性物质的精确度(7 0%)较高(6 5%)7。然而,一个特例出现于强胚胎毒性化学品氯化甲基汞的错误分类,在8个试验中的4个试验里,被预测为无胚胎毒性的化学品,而不是强胚胎毒性的化学品。这种误分类出现的原因可能是用于建立预测模型的训练集未包括具有类似细胞毒性模式的化学品6。G B/T3 5 5 2 02 0 1 7化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验1 范围本标准规定了化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验的术语和定义、试验原理、试验方法、质量控制和结果评价。本标准适用于应用胚胎干细胞试验测试化学品的胚胎毒性。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1 半数分化抑制浓度 m e d i a ni n h i b i t i o no fd i f f e r e n t i a t i o nI D5 0化学品抑制5 0%E S细胞分化为心肌细胞的浓度。2.2 D 3细胞半数生长抑制浓度 m e d i a ni n h i b i t i o no f g r o w t ho fD 3I C5 0D 3化学品抑制5 0%E S细胞系D 3生长和活性的浓度。2.3 3 T 3细胞半数生长抑制浓度 m e d i a ni n h i b i t i o no f g r o w t ho f 3 T 3I C5 03 T 3化学品抑制5 0%3 T 3细胞生长和活性的浓度。3 试验原理胚胎毒性测试或用妊娠动物进行体内试验,或用培养的胚胎以及取自妊娠动物的胚胎组织、细胞进行体外试验。不管体内还是体外测试,都得处死妊娠动物8。利用胚胎干细胞体外培养无限增殖与分化的潜能,提出了一种利用小鼠永生化细胞系的体外胚胎毒性测试,即胚胎干细胞试验9。本试验是基于胚胎毒性作用中最重要的指标,即受试物对胚胎组织和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异,这种差异与胚胎分化抑制密切相关。使用两个永生化小鼠细胞系,E S细胞(D 3)和纤维母细胞(3 T 3细胞)分别表示胚胎组织和成体组织。只有在添加小鼠白血病抑制因子(m L I F)的培养条件下,E S细胞保持在未分化阶段才可进行该试验。去除未分化状态,E S细胞会形成拟胚体(E B),并在适当条件下分化为主要胚胎组织。细胞毒性数据表明,E S细胞比成体细胞对毒性药剂更敏感1。E S细胞分化抑制和E S细胞与3 T 3细胞生长抑制是E S T中用于预测化学品潜在胚胎毒性的3个选用的终点。1G B/T3 5 5 2 02 0 1 74 试验方法4.1 材料4.1.1 细胞系B A L B/c 3 T 3细胞,细胞克隆A 3 1号,建议使用德国,E s c h e w e g e,I C N-F l o w(编号:0 3-4 6 5-8 3)或美国典型培养物保藏中心(AT C C;编号:C C L-1 6 3)。小鼠E S细胞D 3,建议使用R o l fK e m l e r教授(德国弗莱堡马克斯普朗克研究所)或美国典型培养物保藏中心(AT C C;编号:C R L-1 9 3 4)。若使用其他来源细胞,需验证其有效性。4.1.2 主要设备细胞培养箱(3 71,5%1%C O2)、层流洁净工作台、水浴槽(3 71)、相差显微镜、酶标仪、细胞计数器等。4.1.3 化学品、培养基、血清DMEM培养基、L-谷氨酰胺、胎牛血清(F C S)、胰蛋白酶/E D T A溶液、青霉素/链霉素、二甲亚砜(DM S O)、非必需氨基酸(NAA)、-巯基乙醇(-ME)、小鼠白血病抑制因子(m L I F)、噻唑蓝(MT T)、异丙醇、十二烷基磺酸钠(S D S)、不含钙镁的磷酸盐缓冲液(P B S)、5-氟尿嘧啶(5-F U)、青霉素G、台盼蓝、乙醇等。4.2 试剂的准备4.2.1 小鼠白血病抑制因子产品原液(m L I F)进行E S细胞常规传代时直接加入培养板或培养瓶。L I F溶液浓度为1 06U/m L,-2 0下分装储存。解冻后,将分装L I F溶液储存在4(1年稳定)。如果使用浓度为1 07U/m L的L I F,则在P B S(含1%B S A)或细胞培养基中制备11 0稀释液,并按照厂家说明书如上进行储存。4.2.2 胎牛血清F C S解冻后在5 6下3 0m i n热灭活。4.2.3-巯基乙醇在P B S中制备1 0mm o l/L-ME工作液,最长可使用1周(4储存)。4.2.4 完全培养基制备不含L I F的完全培养基。完全培养基最长使用1周(4储存)。完全培养基配方见表1。表1 完全培养基配方用途3 T 3细胞E S细胞常规培养1 0%F C S,4mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0U/m L青霉素,5 0g/m L链霉素2 0%F C S,2 mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0 U/m L青霉素,5 0g/m L链 霉 素,1%NAA,0.1 mm o l/L-ME,10 0 0U/m LmL I F(直接加入培养板中)2G B/T3 5 5 2 02 0 1 7表1(续)用途3 T 3细胞E S细胞试验1 0%F C S,4mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0U/m L青霉素,5 0g/m L链霉素2 0%F C S,2 mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0 U/m L青霉素,5 0g/m L链霉素,1%NAA,0.1mm o l/L-ME冻存2 0%F C S,4mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0U/m L青霉素,5 0g/m L链霉素,1 0%DM S O4 0%F C S,2 mm o l/LL-谷氨酰胺,5 0 U/m L青霉素,5 0g/m L链 霉 素,1%NAA,0.1 mm o l/L-ME,1 0%DM S O4.2.5 MT T溶液以P B S制备5m gMT T/m L储备溶液,过滤(0.2m),分装储存于-2 0。4.2.6 MT T裂解液3.4 9m L2 0%S D S储备溶液(终浓度为0.7%),加9 6.5 1m L异丙醇。临用现配(若出现沉淀物,加热至3 7)。4.3 试验步骤4.3.1 E S细胞分化试验(I D5 0测定)4.3.1.1 受试化学品所用溶剂及最大试验浓度选择参见附录A,浓度级数的设计参见附录B。溶剂终浓度应保持一致,无细胞毒性,不应对细胞分化产生任何其他影响。所有化学品的最高受试溶度为10 0 0g/m L。不应使用完全培养基(含添加物)配制储备液,避免血清蛋白、受试化学品或其他成分反复冻融时产生沉淀。4.3.1.2 进行各试验前对化学品称重和溶解,包括作为阳性对照的5-F U。第3天和第5天使用时(更换培养基),可使用试验开始前制备的储备液(若在-2 0 分装储存)。阳性对照和阴性对照化学品盘尼西林G可从1 0 0m g/m LP B S冷冻储备溶液中配制,阳性对照5-F U为固定浓度。4.3.1.3 由于强酸和强碱可能会影响培养基的缓冲容量,培养基稀释后需通过光学检测给出化学品最高测试浓度的p H值。如果培养基变为紫色或金黄色(p H8或p H且2类:胚胎毒性弱若且3类:胚胎毒性强若且7G B/T3 5 5 2 02 0 1 7附 录 A(资料性附录)受试化学品溶解度预测试受试化学品溶解度的预测试见图A.1。说明:DMEM 无添加培养基;培养基 完全培养基;细胞毒性和分化试验中要使用的溶剂最高终浓度应为:P B S或DMEM,1%;乙醇,0.5%;P B S中5 0%乙醇,1%;DM S O,0.2 5%。图A.1 受试化学品溶解度预测试方案8G B/T3 5 5 2 02 0 1 7附 录 B(资料性附录)十进制几何浓度序列一般情况下,剂量反应关系为非线性,但可通过x轴对数变换在一定程度上使其线性化。通过回归分析或图解估计计算I C5 0值需这样处理。如果采用等差法确定剂量级数,x轴变换会导致测定点分布不均。因此,建议采用几何浓度级数(固定稀释因子)。最简单的几何级数是对倍几何级数,如因子2。H a c k e n b e r g和B a r t l i n g首先在毒理学和药理学研究中使用十进制几何浓度序列稀释法,其优点是便于比较剂量宽和剂量窄的独立试验,而且可一起计算。如图B.1所示,3.1 6的稀释因子将1 01 0 0的一个l o g单位分为等距离的2级,2.1 5的稀释因子分为3级,1.4 7稀释因子分为6级,1.2 1稀释因子分为1 2级。103 1.61 0 0102 1.54 6.61 0 0101 4.72 1.53 1.64 6.66 8.11 0 0101 2.11 4.71 7.82 1.52 6.13 1.63 8.24 6.65 6.16 8.18 2.21 0 0图B.1 十进制几何序列设计示例因此,为实现更简便的数据生物统计评估,建议使用十进制几何浓度级数而非对倍几何级数。十进制几何浓度级数很容易得出