GBT 28068-2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

GB/T28068-20113.7柑桔遗疡病菌重组质粒利用特异性引物扩增柑桔遗疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)基因组模板，获得的柑桔遗疡菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔遗疡病菌检测的阳性对照。4柑桔遗疡病菌基本信息拉丁学名：柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanthomonas citri subsp.citri Gabriel et.al(l989)。病害名称：柑桔遗疡病citrus cancer disease,.分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas,柑桔黄单胞Xanthomonascitri Gabriel et.al(1989).主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和枳等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径；田间则主要由夹风雨和农事操作传播。柑桔愤疡病菌其他信息参见附录A。利用柑桔遗疡病菌亚种通用引物对XccF05/XccRO5,以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱檬亚种(BC/D菌系)（检测引物、检测方法及结果判定参见附录B)。5方法原理本标准采用的实时荧光PC检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法），或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5？端和3端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TqDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测（荧光探针法）。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的Ct值不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。6实验室设置柑桔遗疡病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理。检测实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区和检测区；每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。7材料与试剂7.1仪器与器材7.1.1实时荧光PCR仪。7.1.2高速台式离心机。7.1.3生物安全柜或超净工作台。2