GBT 26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测.pdf

GB/T26428-2010样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699,1执行。6试样的制备按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。7操作步骤7.1检样制备、初始悬液和十倍稀释以无菌操作称取试样25g(mL),加人225mL0.85%灭菌生理盐水，均质1min2min,制成1：10的初始悬浮液。吸取1：10的初始悬浮液1mL,加入9mL0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1：100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。7.2接种和培养选择2个3个适宜的稀释度，水浴80士1维持10min,用无菌移液管分别吸取0.1mL,接种到两个营养琼脂平板(3.2)上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置37士1培养箱中培养48h土2h。7.3菌落计数及筛选培养后，选取菌落数在30个300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。典型枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，不闪光，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则形，灰白色或微黄色。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。7.4确证试验7.4.1概述目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。7.4.2菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于营养琼脂平板上，37士1培养48h士2h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。7.4.3形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(3.3)镜检。枯草芽孢杆菌细胞应为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。7.4.4生理生化确证试验将挑选纯化的菌落进行7%氯化钠生长(3.4)、V-P测定(3.5)、硝酸盐还原(3.6)、D甘露醇发酵(3.7)和丙酸盐利用(3.8)试验。