GBT 25887-2010 奶牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP法.pdf

l C S6 5 0 2 0 3 0B4 3a 雪中华人民共和国国家标准G B T2 5 8 8 7 2 010奶牛脊椎畸形综合征检测P C R 砌几P 法M e t h o do fP C R _ I 江L Pf b rd e t e c t i n go 叩1 p l 旺触b r a lm a l f 0 朋m a t i i n 蜘c a t t l e2 0 1 1 0 卜1 0 发布2 0 1 1 0 6 0 1 实施宰瞀嬲紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪1 9刖舌本标准的附录B 为规范性附录，附录A、附录c 为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军。G B T2 5 8 8 7 2 0 1 0奶牛脊椎畸形综合征检测P C R _ R F L P 法1 范围本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的P c R-R F L P 检测技术。本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断。2 规范性引用文件G B T2 5 8 8 7 2 010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓勋根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1奶牛脊椎畸形综合征c 咖p l 既v e r t e b r a lm a l f o r m a t j 蚰i nd a i r yc a t t l e；c V M奶牛的一种常染色体隐性遗传病，主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡，患病犊牛主要症状表现为：颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。3 2S L C 3 5 A 3 基因S L C 3 5 A 3 辨n e定位于牛第3 号染色体上，在基因序列数据库(G e n B a n k)中的登录号为A Y l 6 0 6 8 3，全长1 4 9 0 1 b p，m R N A 为9 8 1 b p，由7 个外显子和6 个内含子组成，该基因编码核糖转运蛋白，与脊柱发育有关，是奶牛脊椎畸形综合征的致病基因。3 3限制性片段长度多态性r 姻t r i c t i 蚰f r a 蛐蜘t l e n g t hp o I y m o r p h i s m，R F L P检测D N A 用限制性内切酶酶切后形成的特定D N A 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段D N A 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致R F L P 的产生。4 原理s L c 3 5 A 3 基因第四外显子中第5 5 9 位碱基由G 突变为T 时，其对应编码的氨基酸由缬氨酸改变为苯丙氨酸，导致奶牛脊椎畸形综合征的发生。采用P c R-R F L P 技术检测牛样本基因组D N A 变异，即采用P c R 技术扩增s L c 3 5 A 3 基因片段。限制性内切酶消化P c R 扩增产物，电泳检测酶切产物，对s L c 3 5 A 3 基因进行分型，根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因。5 扩增s L c 3 5 A 3 基因片段的引入酶切位点P c R 引物5 C C A C T G G A A A A A C A T G C T G T G A G T A3 57 G C T C T C C T C T G T A A T C C C C A3 预期扩增长度为2 2 5b p。1G B T2 5 8 8 7 2 0 1 06 试剂和仪器6 1 主要试剂水应符合G B T6 6 8 2 的灭菌双蒸水。T k q D N A 聚合酶及P c R 缓冲液、R s n I 限制内切酶及1 0 酶切缓冲液、蛋白酶K、D N A 分子质量标记购自试剂公司。T E 缓冲液、T A E 缓冲液、T B E 缓冲液、P B s 缓冲液、加样缓冲液、1 0 过硫酸铵、3 0 丙烯酰胺、1 0 聚丙烯酰胺、溴化乙锭、1 0 s D s、1m 0 1 LT r i H c l、o 5m 0 1 LE D T A(p H 8 o)、三氯甲烷异戊醇(2 4：1)、3m o l L 乙酸钠、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。6 2 主要仪器冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度P c R 仪、电泳仪、凝胶成像系统、p H 计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。7 检测步骤7 1 牛基因组D N A 制备采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组D N A。4 冰箱中保存备用。7 2P C R 扩增及其产物检测2 0p LP c R 反应体系：o 4p m o l L 引物、o 2m m o l Ld N T P、待测D N A8 5n g 1 0 0n g、1uT 4 口D N A 聚合酶、1 0 P c R 缓冲液，加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。P c R 反应条件：9 4 变性3m i n，3 5 个循环(9 4 3 0s，6 5 3 0s，7 2 3 0s)，7 2 延伸1 0m i n，4 保温2m i n 1 0m i n。取2“L P c R 产物，2 3 琼脂糖凝胶电泳(3 v c m 5 V c m，电泳2 0 m i n 3 0 m i n)，溴化乙锭(E B)染色后，在凝胶成像系统观察条带。P c R 扩增结果示意图见附录B 中的图1。7 3 酶切及其产物检测取1 6p LP c R 扩增产物，加入5u 限制内切酶R mI 和2p L1 0 酶切缓冲液，加水至2 0p L，反应条件参见产品说明书。1 0 1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(3V c m 5V c m，电泳3h 4h)，银染(染色方法参见附录c)。酶切图谱见附录B 中的图B 2。7 4 结果判定由于2 4b p 的条带太小，以致在1 0 1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时显示不出来，但可根据2 2 5b p、2 0 1b p 条带进行样本基因型判定。健康奶牛：基因型为G G 型，即出现2 0 1b p 一条电泳带；隐性携带者：基因型为G T 型，即出现2 2 5b p、2 0 1b p 两条电泳带；C V M 患者：基因型为T T 型，即出现2 2 5b p 一条电泳带。附录A(资料性附录)主要试剂及配制方法表A 1 主要试嗣及配制方法G B T2 5 8 8 7 2 0 1 0试剂配制方法T E 缓冲液1 0m m o l LT r i s _ H C l(p H 8 0)，1m m o l LE D T A(p H 8 O)2 4 2gT r i s 碱，5 7m L 冰乙酸，1 0 0m Lo 5m 0 1 LE D T A(p H 8 o)，加双蒸水定容至5 0 T A E 缓冲液10 0 0m L，使用时5 0 倍稀释1 0 过硫酸铵称取1g 过硫酸铵溶于8 m L 双蒸水，定容至1 0 m L5 4 og T r i s 碱，2 7 5g 硼酸，2 0m LO 5m m o l L E D T A(p H 8 O)，加双蒸水定容至5 T B E 缓冲液10 0 0m L，使用时5 倍稀释3 0 丙烯酰胺(丙烯酰胺：甲叉3 0 0m L 双蒸水中溶解1 4 5g 丙烯酰胺，5g 甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水定容至双丙烯酰胺=2 9t1)5 0 0 m L量取9 3m L3 0 丙烯酰胺，1 8 5m L 双蒸水，7m L5 T B E，o 2 3m Ll o 过硫酸1 0 聚丙烯酰胺铵，O 0 2m L T E M E D加样缓冲液o 2 5 溴酚蓝(质量浓度)，4 0“蔗糖(质量浓度)1 0 0m L 双蒸水中加人o 1gE B(1 0m g m L)，搅拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，溴化乙锭(E B)锡箔包裹氯化钠8g。磷酸氢二钠1 4 4g，氯化钾o 2g，磷酸二氢钾o 2 4g 加双蒸水定容至P B S 缓冲液10 0 0m L，调p H 值至7 o，高压灭菌，室温保存1 0 s D s称取5 0gS D s 加热溶于4 0 0 m L 双蒸水中，定容至5 0 0m L，高压灭菌，室温保存称取1 2 1 4g s 碱溶于8 0 0n l L 双蒸水中，加浓盐酸调至p H 8 o，定容到1o o on 1 L，1m 0 1 LT r i s _ H C l高压灭菌，室温保存称取1 8 6 1g 二水乙二胺四乙酸二钠溶于8 0 0m L 双蒸水中，加入氢氧化钠(约O 5m o l LE D T A(p H 8 O)2 0g)调至p H 8 0，定容到10 0 0m L，高压灭菌，室温保存三氯甲烷异戊醇(2 4：1)量取4 8 0m L 三氧甲烷，加人2 0m L 异戊醇，混匀称取4 0 8 1g 三水乙酸钠溶于8 0 0m L 双蒸水中，用乙酸调至p H 5 2，加水定容至3m 0 1 L 乙酸钠10 0 0m L，高压灭菌，室温保存固定液4 5 0m L 双蒸水中加入5 0m L 乙醇脱色液4 9 z 5m L 双蒸水中加入7 5m L 浓硝酸染色液5 0 0m L 双蒸水中溶解1g 硝酸银，置棕色瓶中保存5 0 0 m L 双蒸水中溶解1 5g 无水碳酸钠，加人1 3 2 m L 甲醛(o 0 4 6)，用双蒸水定显影液容至10 0 0m L停显液4 8 5m L 双蒸水中加人1 5m L 冰乙酸3附录C(资料性附录)凝胶染色方法G B T2 5 8 8 7 2 0 10c 1电泳完毕，取下玻璃板，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来，放人双蒸水中漂洗一次，然后浸入1 0 乙醇溶液固定5m i n 1 0m i n。c 2 用1 硝酸脱色3m i n 8m i n，然后双蒸水迅速漂洗次。c 3o 2 硝酸银晃动闭光染胶1 5m i n 2 5m i n；染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次l os)，洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。c 4 在染胶盒中倒人含3 碳酸钠和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。c 5 注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3 的乙酸溶液，浸泡1 0m i n 停显。