GBT 23502-2009 食品中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法.pdf

ICS67.050X 04GB/T23502-2009亻咖中 华 人民 共 和 国 国 家 标 准食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法Determination of ochratoxin A in food-High performanceliquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up2009冖 04-08发布2009-05-01 勇 臼 色中华人民共和国国家质量监督检嗖墅溽异垦 发布中 国 国 家 标 准 化 管 理GB/T23502-2009本标准的附录A为资料性附录。本标准 由全 国食品工业标准化技术委员会(SC/TC64)提出。本标准 由全国食 品工业标准化技术委员会食 品通用检测技术分技术委员会(SAC/TC64/SC8)归口。本标准起草单位:青岛市产品质量监督检验所、中华人 民共和国山东 出人境检验检疫局、中检维康技术有限公司、青岛啤酒股份有限公司。本标准主要起草人:吴如军、鲍蕾、张辉珍、李惠颖、张鹏、余俊红、王雄。亠刖口GB/T23502-2009食品中赭 曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法1 范围、本标准规定了食品中赭 曲霉毒素含量的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。本标准适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中赭曲霉毒素A含量的测定。本标准的方法检出限:粮食和粮食制品的检 出限为1.0u g/k g,酒类的检 出限为0.1u g/k g,酱油、醋、酱及酱制品的检出限为0.5u g/k g。2 规范性引用文件下列文件 中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期 的引用文仵,其 随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或 修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议 的各方研究是否可使用这些文件 的最新版本。凡是不注 日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2 分析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法(G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8,I S 0 3 6 9 6:1 9 8 7,M O D)3 方法提要用提取液提取试样 中的赭 曲霉毒素,经免疫亲和柱净化后,用高效液相色谱荧光检测器测定,外|标法定量。4 试剂和材料除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1 甲醇:色谱纯。4.2 乙腈:色谱纯。4.3 冰乙酸:色谱纯。4.4 提取液1:甲醇+水(80+)。4.5 提取液2:称取150g 氯化钠、z O g 碳酸氢钠溶于约950m L水中,加水定容至1L。4.6 冲洗液:称取25g 氯化钠、5g 碳酸氢钠溶于约950m L水中,加水定容至1L。4.7 真菌毒素清洗缓冲液:称取25.0g 氯化钠、5.0g 碳酸氢钠溶于水 中,加人0.1m L吐温20,用水 稀释至 1L。f 4.8 赭曲 霉 毒 素A标准 品:纯 度 98%。/4.9 赭曲霉毒素标准储备液:准确称取一定量的赭曲霉毒素标准品,用 甲醇+乙 腈(1+D溶解,配成0.1m 酽m L的标准储备液,在-20保存,可使用3个月。4.10 赭曲霉毒素标准工作液:根据使用需要,准确吸取一定量的赭曲霉毒素A储备液,用流动相稀释,分别配成相当于1 ng/mL、5 ng/mL、1 0 ng/mL、ng/mI 、5 0 ng/mL 的标准工作液,4 保存,可使用7d。4.l 1 赭曲霉毒素A免疫亲和柱。4.1 2 玻璃纤维滤纸:直径1 1 cm,孔径1.5 um,无荧光特性。5 仪器和设备5.1 天平:感量0.0 0 1 g。1GB/T2350220095.2 高效 液相 色谱仪:配 有荧光检 测器。5,3 均质器:转速大于1 0 0 0 0 r/min。5.4 高速万能粉碎机:转速1 0 0 0 0 r/min。5.5 玻璃注射器:1 0 mL。5.6 试验筛:1 mm孔径。5.7 空气压力泵。5.8 超声波发生器:功率大于180W。6 分析步骤6.1 试样的制备与提取6.1.1 粮食和粮食制品:将样品研磨,硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(5.6),不要磨成粉末。称取20g(精确到0,01g)磨碎 的试样 于100m L容量瓶 中,加 人5g 氯化钠,用 提取液1(4.4)定容至刻度,混匀,转移至均质杯 中,高速搅拌提取2m i n。定量滤纸过滤,移 取10.0m L滤液于50m L容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,用 玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,收集 滤液A于干净 的容器中。6.1.2 酒类:取脱气酒类试样(含 二氧化碳 的酒类样 品使用前先置于4冰箱冷藏30m i n,过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样g(精 确到0.01g),置于25m L容量瓶中,加提取液2(4.5)定容至刻度,混匀,用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,收集滤液B于干净的容器中。6.1.3 酱油、醋、酱及酱制品:称取25g(精确到0.01g)混匀的试样,用提取液1(4.4)定容至50.0m L,超声提取5m i n。定量滤纸过滤,移取10.0m L滤液于50m L容量瓶 中,加水定容至刻度,混匀,用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,收集滤液C于干净的容器中。6.2 净化6.2.1 粮食和粮食制品:将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(5.5)下,准 确移取6.1中滤液A10.0m L,注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调 节压力,使溶液 以约1滴/s 的 流速通过免疫亲和柱,直 至空气进人亲和柱 中,依次用10m L真菌毒素清洗缓 冲液(在.7)、10m L水淋洗免疫亲和柱,流速约为1滴/s 2滴/s,弃 去全部流出液,抽干小柱。6.2.2 酒类:将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(5.5)下,准 确移取6.1中滤液B10.O m L,注入玻璃注射器 中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液 以约1滴/s 的 流速通过免疫亲和柱,直至空气进人亲和柱 中,依 次 用10m L冲洗 液(4.、10m L水淋洗免 疫 亲和柱,流 速约为1滴/s 2滴/s,弃 去全部流出液,抽 干小柱。6.2.3 酱油、醋、酱及酱制 品:将 免疫亲和柱 连接 于玻璃注射器(5.5)下,准 确移取6.1中滤液C10.0m L,注人玻璃注射器 中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调 节压力,使 溶液以约1滴/s 的 流速通过免疫亲和柱,直 至空气进人亲和柱中,依 次用10m L真菌毒素清洗缓 冲液(4.7)、10m L水淋洗免疫亲和柱,流速约为l 滴/s 2滴/s,弃 去全部流出液,抽干小柱。6,3 洗脱准确加入1.0m L甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收 集全部洗脱液于干净 的玻璃试管 中,用 甲醇定容至1m L,供HPLC测定。6.4 高效液相色谱参考条件a)色谱柱:C 1:柱,5 u m,1 5 0 m m 4.6 m m 或相当者;b)流动相:乙腈+水+冰乙酸(99+99+2);c)流速:0.9 mL/min;d)柱温:35;e)进样量:1 0 uL 1 0 0 uL;2GB/T23502一2009f)检测波长:激发波长3 3 3 nm,发射波长4 7 7 nm。6.5 定量测定以赭 曲霉毒素A标准工作溶液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作 曲线,用 标准工作曲线对试样进行定量,标 准工作溶液和试样溶液中赭曲霉毒素A的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下,赭 曲霉毒素A标准品色谱图参见图A.1。6.6 空白试验除不加试样外,空 白试验应与测定平行进行,并采用相同的分析步骤。6,7 平行试验按以上步骤,对 同一试样进行平行试验测定。7 结果计算试样 中赭曲霉毒素A的含量按式(1)计 算:x=(臼一c)V lO m 7河 1000式中:(1)X-试样中赭曲霉毒素的含量,单位为微克每千克(u 酽 k g);c l-试样溶液中赭 曲霉毒素A的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);旬一 空白试样溶液 中赭 曲霉毒素的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V甲醇洗脱液体积,单位为毫升(m L);御 试样的质量,单位为克(g);广一 稀 释倍数检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。8 回收率添加浓度在1.0 ug/kg1 0.0 u酽kg时,回收率在7 0%1 0 0%之问。9 重复性在重复性条件下,获 得 的赭 曲霉毒素A的两次独立测试结果 的绝对差值 不 大于其算 术 平 均值的10%。GB/T23502200970 060.o50.040.030 020 010.o-5 o附 录 A(资 料性 附录)赭 曲霉毒 素A标准 品的液相色谱 图 月、冖2.50图A。1 赭曲霉毒素A标准品液相色谱图发射波:4 7 7 n m版权专有 侵杈必究书 号:1 5 5 0 6 6 3 6 9 亻9oool忒0臼07.50GB/T 23502-2009打 印 H期:09午 6丿j 1H 定价:14.00元