GBT 22917-2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

GB/T22917-2008猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2.1荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。2.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。2.3 RNA核糖核酸。2.4 DEPC焦碳酸磷酯，2.5PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A。2.6Tag酶Tag DNA聚合。2.7 SVDV猪水泡病病毒。3原理根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。引物和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株。荧光探针的5端标记FAM荧光素，3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号。扩增时，由于Tq酶的53的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。4材料与试剂4.】仪器与器材4.1.1荧光RT-PCR检测仪。4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.1.3台式离心机或手掌式离心机（离心速度3000r/min).4.1.4混匀器。4.1.5冰箱(2一8和-20两种).4.1.6微量可调移液器(5L,10L,100L,1000L)及配套带滤芯吸头。4.1.7l.5mL、0.5mL硅化Eppendorf管：将Eppendorf管和滴头浸泡于含有0.1%DEP的三蒸水中过夜，l21土2高压灭菌l5min,40烘干备用。市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接1