GBT 27540-2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

I C S1 1 2 2 0B4 1a 园中华人民共$-n 国国家标准G B T2 7 5 4 0 2 01 1猪瘟病毒实时荧光R T P C R 检测方法M e t h o do ft h er e a l-t i m eR T P C Rf o rt h ed e t e c t i o no fc l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u s2 0 11 1 1 2 1 发布2 0 1 2-0 3-0 1 实施丰瞀徽紫瓣警攒瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厦1 9刚置G B T2 7 5 4 0 一2 011本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(S A C T C1 8 1)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。1 范围猪瘟病毒实时荧光R T P C R 检测方法G B T2 7 5 4 0 2 01 1本标准规定了猪瘟病毒(C l a s s i c a ls w i n e e v e rv i r u s，C S F V)实时荧光R T P C R 检测方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中C S F V 核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第3 0 2 号兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本文件。C S F V：猪瘟病毒(C l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u s)C t 值：达到阈值的循环数(c y c l et h r e s h o l d)D E P C：焦碳酸二乙酯(d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e)H ST a q 酶：热启动T a qD N A 聚合酶(H ST a qD N Ap o l y m e r a s e)R N A：核糖核酸(r i b o n u c l e i ca c i d)荧光R T-P C R：荧光逆转录聚合酶链式反应(r e a lt i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)4 试剂和材料除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无R N A 酶的容器分装。4 1T r i z o l：R N A 抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4 8 保存。4 2 氯仿：4 预冷。4 3 异丙醇：4 预冷。4 47 5 乙醇：用新开启的无水乙醇和D E P C 水配制，一2 0 预冷。4 5D E P C 水：去离子水中加入0 1 D E P C，3 7 作用1h，(1 2 1 土2)，高压灭菌1 5m i n。4 6R N A 酶抑制剂(3 0U t-L)。4 71 0 P C Rb u f f e r(1 0m m o l Lp H 8 3 T r i s H C I，5 0m m o l LK C I，1 5m m o l LM g C l 2)。4 8d N T P(2 5m m o l L)。4 9 用于R T P C R 反应的引物浓度为1 0p m o l L，探针浓度为5g m o l L，其序列如下：上游引物F：5 一T A C A G G A C A G T C G T C A G T A G T T C G A 一3G B T2 7 5 4 0 2 01 1下游引物R：5 一C C G C T A G G G T T A A G G T G T G T C T-3探针P：5-F A M C C C A C C T C G A G A T G C T A T G T G G A CG A T A M R A 一34 1 0 反转录酶：S u p e r s c r i p t I I 反转录酶(2 0 0U p L)。4 1 1D N A 聚合酶：H S T a q D N A 聚合酶(5u“L)。4 1 2 阴性对照：D E P C 水。4 1 3 强阳性对照：非感染体外转录R N A(42 0 0p g p L)。4 1 4 弱阳性对照：非感染体外转录R N A(4 2p g p-L)。5 器材和设备5 1高速台式冷冻离心机：最大离心力1 20 0 0 9 以上。5 2 冰箱。5 3 荧光P c R 检测仪。5 4 组织匀浆器。5 5 微量移液器和吸头。5 6 离心管。6 样品的采集6 1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴次性手套，样本不得交叉污染。6 2 采样工具扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3 氢氧化钠溶液浸泡消毒5m i n 1 0r n i n经清水冲洗。灭菌牙签和0 5m L 或1 5m L 离心管经(1 2 1 士2)，高压灭菌1 5r a i n；剪、镊经1 6 0 干烤2h。6 3 采样方法6 3 1 活体样品固定活猪的上唇，用开口器打开E l 腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0 5m L 或1 5m L离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1：5 倍体积加入D E P C 水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，30 0 0 9 离心1,5m i n，取上清液转入离心管中编号备用。6 3 2 内脏样品采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取5 0r n g 1 0 0m g 待检样品，按1：5 倍体积加入D E P C 水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，30 0 0 9 离心1 sr a i n，取上清液转入离心管中编号备用。6 3 34 E D T A 抗凝血用无菌注射器直接全血，注入含1 1 04 E D T A 溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。2G B T2 7 5 4 0 2 0116 3 4 排泄物挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温30 0 0 9 离心1 5m i n，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。6 3 5 细胞培养物细胞培养物冻融3 次，转入离心管中编号备用。6 4 存放与运送采集或处理的样品在2 8 条件下保存应不超过2 4h；若需长期保存，应放置一7 0 冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3 次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h 8h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7 实时荧光R T-P C R 检测7 1 核酸提取在样本制备区进行。7 1 1 取n 个灭菌的1 5m L 离心管，其中n 为待检样品数重复数3+阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。7 1 2 每管加入5 0 0p L T r i z o|，分别加入被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各2 0 0p L(由于阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染)，颠倒l o 次混匀，静置5m i n；再加入2 0 0p L 氯仿，混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀)。于4、1 20 0 0 9 离心1 5m i n。7 1 3 取与7 1 1 中相同数量灭菌的1 5m L 离心管，加入5 0 0p L 异丙醇(4 预冷)，对每个管进行编号。取7 1 2 中离心后的上清液约5 0 0p L(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，一2 0 静置3 0m i n。7 1 4 于4、1 20 0 0 9 离心1 5m i n(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入6 0 0p L7 5 乙醇，颠倒洗涤。7。1 5 于4、1 20 0 0 9 离心1 0m J n(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。7 1 640 0 0 9 离心1 0s(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3m i n 1 0m i n。7 1 7 加入3 8p L 经D E P C 处理的水和2p LR N A 酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的R N A，冰上保存备用。提取的R N A 应在2h 内进行荧光R T-P C R 扩增；若需长期保存应放置-7 0 冰箱。7 2 荧光R T-P C R 扩增体系的配制在反应混合物配制区进行。设P C R 反应数为n，其中n 为待检样品数重复数3 十阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，每个样本测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。3G B T2 7 5 4 0 2 011表1每个样品反应体系配制表体系组分用量终浓度1 0 X P C RB u f e r5 0 t*L1 d N T P s1 5p L0 0 7 5*m o l L猪瘟病毒R T P C R 反应液上游引物F3 Op-LO 6V-r o d L下游引物R3 0 卢L0 6 1 m o l L探针溶液探针PI 5p-L0 1 5*m o l LS u p e r s c r i p t 反转录酶0 3u L2U u L反应酶H S T a qD N A 聚合酶0 5“L0 0 5U 2 L总量1 4 8 L7 3 加样在样本处理区进行。在各设定的荧光R T P C R 管中分别加入本标准7 1 7 中制备的3 5 2p LR N A 溶液，盖紧管盖后5 0 0r m i n 离心3 0S。放人荧光P C R 检测仪内。7 4 荧光R T-P C R 扩增在检测区进行。将本标准7 3 中离心后的P C R 管放人荧光R T-P C R 检测仪内，记录样品摆放顺序。循环条件设置：a)反转录5 0 2 0m i n；b)预变性9 4 4m i n；c)8 8、8S，6 0、3 5S，4 0 个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延伸时进行。7 5 结果判定7 5 1 阈值设定试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和c t 值直接读取检测结果，c t 值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7 5 2 质控标准7 5 2 1阴性对照无c t 值，且无典型扩增曲线。7 5 2 2 强阳性对照的c t 值应 3 4 0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现c t 值3 4 0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。