GBT 22945-2008 蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.pdf

ICs 67.050X O4中 华 人民 共 和国 国 家 标 准GB/T229452008;)它,冫丿?6 C 9 r蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法Determination of streptomycin,dihydrostreptomycinand kanamycin residues in royal jelly-LC-MS-MS method200g-131发布2009-05-01 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发布GB/T229452008口亠刖本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口。本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标准主要起草人:刘 晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、孙海侠、庞国芳。GB/T229452008蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残 留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆 中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残 留量的测定。本标准的方法检 出限:链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.0u g/k g。2 规范性引用文件下列文件 中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件,其 随后所有的修改单(不 包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议 的各方研究是否可使用这些文件 的最新版本。凡是不注 日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1 测量 方 法 与 结 果 的 准 确 度(正 确 度 与 精 密 度)第1部分:总 则 与 定 义(GB/T6379.-2004,ISo 572l:1994,IDT)GB/T6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确 定标准测量方法重复性 与 再 现 性 的 基 本 方 法(GB/T6379.22004,Is O5725乇:1994,IDT)GB/T6682 分析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法(GB/T6682-2008,ISO3696:1987,MOD)3 原理蜂王 浆试 样 中的抗 生素用 磷酸溶 液 提取,二 氯 乙酸沉 淀蛋 白,用 苯磺 酸型 和羧 酸 型 固相萃 取 柱 净化。液相色谱-串联 质谱仪(E+)检测,外 标法定量。4 试剂和材料 除另有说 明外,所 用试剂均为优级纯。4.1 水:G B/T 6 6 8 2,一级。4.2 甲醇:色谱纯。4 3 乙腈:色谱纯。4.4 甲酸。4.5 浓磷酸。4.6 磷酸氢二钾(K 2 H P 0 4)。4.7 三氯乙酸(C 2 H C 1 3 O 2)。4.8 庚烷磺酸钠(C 7 H 1 5 N aO 3 S H 2 0)。4.9 5%磷酸溶液(1+19):取50m L浓磷酸(4.5),用水定容至1L。4.10 0.2m l/L磷酸盐缓冲溶液:p H=8.5。称取34.8g 磷酸氢二钾(4.6)用水溶解,定 容至1L,用氢氧化钠溶液调节 p H=8.5。4.三氯乙酸溶液:50%(质量分数)。取20g 三氯乙酸(4.7),用水定容至 m L。4.1 2 0.0 1 rnol/L 庚烷磺酸钠溶液:称取2。g庚烷磺酸钠(4.8),用水溶解,定容至1 L。4.1 3 S P E 洗脱溶液:取灶mL 甲酸(4.4),用0.0 1 mol/I 庚烷磺酸钠溶液(4.1 2)定容至1 0 0 mL。4.1 4 2 5%甲醇溶液(1+3):取2 5 mL 甲醇(4.,用水定容至1 0 0 mL。GB/T2294-20084.1 5 标准物质:链霉素(C A S:3 8 1-0)、双氢链霉素(C A S:1 2 4 6-1)和卡那霉素(C S:2 5 3 8 9 4 峋),纯度均98%。4.16 1.0m g/m L标准储备溶液:称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质(4.15),分别用o.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0m g/m L的标准储各溶液。避光保存于-18冰柜 中。4.17 0.1u g/m L混合标准溶液:吸 取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液(4.16),用0.3%乙酸水稀释成0。l u g/m L的混合标准溶液,避光保存于-18冰柜 中。4.18 苯磺酸型固相萃取柱(500m g,3m L)或相 当者。使用前依次用5m L甲醇和10m L水预处理,保持柱体湿润。4.19 羧酸型固相萃取柱(5OO m g,3m L)或相 当者。使用前依次用5m L甲醇和l O m L水预处理,保持柱体湿润。4.2 0 滤膜:0.2 um。5 仪器5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源。5.2 分析天平:感量0.1 mg和0.0 1 g。5.3 液体混匀器。5.4 固相萃取装置。5.5 均质器。5.6 真空泵:真空度应达到80k Pa。5.7 微量注射器:2 5 uL,1 0 0 uI 。5.8 pH 计:测量精度0.0 2 pH 单位。5.9 具塞离心管:1 0 0 mL。5.1 0 刻度离心管:5 mL。5.1 1 贮液器:5 0 mL。5.1 2 离心机:转速4 0 0 0 r/min以上。6 试样的制各与保存6.1 试样的制备实验室样品混合均匀,分 出0.5k g 作为试样。6.2 试样保存试样置于-18冰柜,避光保存。7 测定步骤7.1 待测样品溶液的制备7.1.1 样品提取和初净化称取蜂王浆样 品10g(精确到0.01g),置于100m L离心管中,加人30m I 5%磷酸溶液(4.9),均质3m i n 并用5%磷酸溶液清洗均质器刀头,合并洗涤液,加 人3m L三氯 乙酸溶液(厶.11)涡旋混合后在4000r/m i n 下离心 10m i n。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱(衽.18)的贮液器 中,在 固相萃取装置上使样液以小于2m L/m i n 的流速通过萃取柱,待 样液全部通过 固相萃取柱后,依 次用5m L5%磷酸溶液(4.9)和10m L水洗涤苯磺酸型固相萃取柱(4.18),弃去全部流出液。用20m L磷酸盐缓冲溶液(4.10)洗脱至 50m L离心管中。7.1.2 样品溶液再净化上述洗脱液倒人下 接羧酸型 固相萃取柱(4.19)的贮 液器 中,在 固相萃取装 置上使样 液 以小 于2GB/T22945-20082m L/m i n 的流速通过萃取柱,待 样液全部通过 固相萃取柱后,依 次用10m L水和10m L甲醇溶 液(4.14)洗涤羧酸型固相萃取柱(4,19),弃去全部流 出液。减压抽干羧酸型 固相萃取柱(4.19)30m i n。用2m L s PE洗脱液(4.13)洗脱至 5m L刻度离心管中,用 SPE洗脱液(4.13)定容至2.O m L,混匀后过0.2u m 滤膜(4.z O),供液相色谱-串联质谱测定。7.2 基质混合标准校准溶液的制备称取五个阴性蜂王浆样品10g(精确到0.01g),分别置于100m L具塞离心管中,加人适量混合标 准溶液(4.1 7),制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.0 ug/kg、1 0.O ug/kg、2 0.0 ug/kg、1 1 0 0 0 u g/k g 和2 0 0.0 u g/k g 的基 质 标 准 溶 液。其 余 按7,1 步骤 操 作 完 成。7.3 测定条件7.3.1 液相色谱参考条件a)色谱柱:A tlantis C 1:,3.5 um,1 5 0 mm2.1 mm(内径)或相当者;b)柱温:40;c)进样量:3 0 u L;d)流动相:流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,流 动相C为甲醇。梯度洗脱参考条件见表1。表1 液相色谱梯度洗脱参考条件时间/m i n流 速/(u L/m i n)流动相A/%流动相B/%流动相C/%0556.005516.0057.3.2 质谱参考条件a)离子源:电喷雾离子源(E);b)扫描方式:正离子扫描;c)检测方式:多反应监测(MRM);d)电喷 雾 电 压(I S):5 0 0 0 V;e)辅助气(AUX)流速:7L/m i n;f)辅助气温度(TEM):550;g)聚焦 电压(FP):150V;h)链霉 素、双氢链 霉素和卡那霉素 的质谱参数见表2。表2 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱 参数化合物名称定性离子对(/z)定量离子对(/z)去簇 电压(D P)/V采集时间/碰 撞 气能 量(CE)/V链霉素(s t r e p t o m y c i n)582/263582/246582/2634 55 5双氢链霉素d i h y d r o s t r e p t o m y c i n584/26358众/246584/2631004 35 5卡那霉素(k a n a 丁n y c i n 485/163485/324485/1631003 42 33GB/T22g 45_冖20087.4 液相 色谱-串联质谱 测定7.4.1 定性确证每种被测组 分 选择1个母 离 子,2个以上子离子,在 相 同试 验条件下,样 品 中待测 物质 的保 留时 间与混合基质标 准校 准溶液 中对应组 分 的保 留时间偏差在 2.5%之内;且 样 品谱 图中各组分 的相对离子丰度与浓度接近 的混合基 质标 准校 准溶 液谱 图中对应 的相对 离 子 丰度进行 比较,偏 差 不超 过 表3规定的范 围,则 可判定样 品 中存在对应 的待测 物。表3 定性确 证时相对离子 丰度的最大允许偏差 以%表 示7.4.2 定量测定外标法定量:在仪器最佳工作条件下,对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液进样测定,以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准工作 曲线,用标准工作曲线对待测样 品进行定量,样 品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均 回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。7.5 平行试验按 以上步骤,对 同一试样进行平行试验测定。7.6 空白试验不称取样品,其余均按试样步骤进行。7.7 回收率试验阴性样品中添加标准溶液,按7.1和7.2操作,测定后计算样品添加的回收率。8 结果计算链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的残留量按式(1)计 算。x=c券端 (1)式 中:X试样 中被测组分残留量,单位为微克每千克(u 酽 k g);c 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(n 酽 m L);y 样品溶液最终定容体积,单位为毫升(m L);狃样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g)。计算结果应扣除空 白值。9 精密度9.1 一般规定本标准的精密度数 据是按GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定 的,重 复性 和再 现性 的值 以95%的可信度来计算。9,2 重复性在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4。4相对离子丰度K)5020(5010(20K10允许最大偏差=20圭2530=50GB/T22945-2008如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。.3 再现性在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4。表4 添加浓度范 围及重 复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称添加浓度范围重复性 限再现性限R链霉素5.0-2o 0 olgr-7.724 4lgm l.031 6l g R=1.1逐0 11g-1.o 21 3双氢链霉素5.02o o.olgr:1.179 Tlg