GBT 19915.3-2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术.pdf

I C S 0 7.1 0 0.3 0C 5 3药黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 1 9 9 1 5.3-2 0 0 5猪链球菌 2 型 P C R定型检测技术Me t h o d f o r d e t e c t i o n S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 b y P C R2 0 0 5-0 9-2 7发布2 0 0 5-1 1-0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 1 9 9 1 5.3-2 0 0 5月 明舀 猪链球菌病是链球菌属中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌 2型和马链球菌兽疫亚种。猪链球菌 2 型可引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。为控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的检测方法是当务之急。本标准是采用公认的细菌学诊断的现代分子生物学技术制定的。本标准的附录A是规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:南京农业大学。本标准主要起草人:陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。G B/T 1 9 9 1 5.3-2 0 0 5猪链球菌 2 型 P C R定型检测技术范围本标准规定了猪链球菌2型的 P C R的定型方法。本标准适用于由猪链球菌 2 型引致的病死猪分离菌的检测和定型。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2分析实验室用水规格和试验卞法术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 猪链球菌2 型 S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为 1 -3 4及 1/2 共 3 5 个血清型。猪链球菌 2 型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4测定方法4.1 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落加人 P C R反应管中，进行P C R扩增，琼脂糖凝胶电泳检测P C R产物，与标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小。4.2 试荆和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2的灭菌双蒸水。4.2.1 猪链球菌2型定型 P C R反应混合物和猪链球菌2型定型套式 P C R反应混合物。4.2.2 T a q D N A聚 合酶。4.2.3 琼脂糖:电泳级。4.2.4 嗅化乙锭。4.2.5 分子量标记:D L-2 0 0 0,4.2.6 T E缓冲液:1 0 m mo l/L T r i s-H C I(p H 8.0),l mm o l/L E D T A(p H 8.0),4.2.7 1 0 X P C R缓冲液:1 0 0 mm o l/L K C 1,1 6 0 mm o l/L(NH,)z S O-2 0 mmo l/L Mg S O 2 0 0 mm o l/LT r is-HC I(p H 8.8),1 0 o T r i t o n X-1 0 0,1 mg/mL B S A.4.2.8 电泳缓冲液:2 4 2 g T r is 碱，5 7.1 mL冰乙酸，1 0 0 m L 0.5 mo l/L E D T A(p H8.0)，加蒸馏水至1 0 0 0 mL，使用时 1 0 倍稀释。4.2.9 加样缓冲液:0.2 5 澳酚蓝，4 0%蔗糖。4.2.1 0 荚膜基因P C R引物和英膜基因套式 P C R引物。4.2.1 1 阳性对照和阴性对照。GB/T 1 9 9 1 5.3-2 0 0 54.3 仪器和设备4.3.1 离心机。4.3.2 DN A热循环仪。4.3.3 核酸电泳仪。4.3.4 p H计。4.3.5 移液器:1 0 p L,2 0 p L,1 0 0 p L,l 0 0 0 p L,4.3.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.4 英膜墓因P C R操作步骤4.4.1 P C R扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌 2型定型 P C R反应混合物的P C R管中，混匀，加人T a q 酶(5 U/p L)0.5 li L,2 0 0 0 r/m i n 离心1 0 s，立即进行P C R扩增，同时 设阳性对照和阴性对照。扩增条件为:9 5 0C 预变性3 m i n;9 5 0C 2 0 s,5 5 0C 3 0 s,7 2 0C 4 0 s,3 0 个循环;7 2 延伸7 m i n,V C保存。4.4.2 P C R产物回收 按 S a n g o n g P C R产物回收试剂盒说明书进行。4.4.2.1 在 2 5 p L P C R产物中加人 1 0 0 p L结合缓冲液II(b i n d i n g b u f f e r II),混匀。4.4.2.2 将混合物转移到 2 mL收集管内的 UN I Q-1 0柱中，室温放置 2 mi n,1 2 0 0 0 g室温离心1 m i n,4.4.2.3 倒掉收集管中废液，将 U N I 奋1 0 柱放置同一个收集管中，加人2 5 0 p L洗液(w a s h s o l u t i o n),1 2 0 0 0 g室温离心 1 mi n,4.4.2.4 倒掉收集管中废液，重复步骤4.4.2.3 一次。4.4.2.5 取下UNI Q-1 0柱，倒掉收集管中的废液，将 UN I Q-1 0 柱放人同一个收集管中，1 2 0 0 0g室温离心1 m i n,4.4.2.6 将 U N I Q-1 0 柱放人一根新的1.5 m L 微量离心管中，在柱子膜中央加 1 2 p L洗脱缓冲液(e l u t i o n b u f f e r)，3 7 放置 2 min,4.4.2.7 1 2 0 0 0 g 室温离心1 m i n，收 集回收液。4.4.3酶切 0.5 mL E p e n d o f f 管中依次加人:D N A(P C R回收产物)8.0 p L Hi n d 1 1 1.0 pL 1 0 X b u f f e r 1.0 pL 混匀，3 7 0 C 酶切 2 h,4.4.4 琼脂箱凝胶电泳 在电泳缓冲液中加人 1%琼脂搪，加热融化后加人澳化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8 p L酶切产物加人 2 p L 5 X上样缓冲液，混匀后加人上样孔，8 0 V恒压电泳 2 0 mi n,紫外线透射检测。4.4.5 检测猪链球菌 2 型英膜荃因的套式 P C R 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌 2 型定型套式 P C R反应混合物的P C R管中，混匀，加人 T a q 酶(5 U加L)1.0 p L,2 0 0 0 r/mi n 离心1 0 s，立即进行 P C R扩增。扩增条件为:9 5 C预变性 3 mi n;9 5 0 C 4 0 s,5 5 0 C 3 0 s,7 2 0C4 0 s,3 0 个循环;7 2 延伸 7 m i n,4 保存。给果及判 断5.1 试验结果成立条件 阳性对照经英膜基因 P C R扩增产物酶切后出现 1 6 4 b y和 2 2 3 b y两条条带后，阳性对照经套式GB/T 1 9 9 1 5.3-2 0 0 5P C R出现1 7 8 b y 及3 8 7 b y 两条条带，阴 性对照P C R产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。5.2 结果判断 在试验结果成立的 前提下，如果样品中 英膜基因P C R产物酶切后出 现1 6 4 b y 和2 2 3 饰两条条带，或套式P C R出 现1 7 8 b y 及3 8 7 饰两条条带，表明 猪链球菌2 型英膜基因阳 性，再结合液体培养出 现短链的特性，可确诊为猪链 球菌 2型。6 座弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物.应收集后高压灭菌处理。GB/T 1 9 91 5.3-2 0 0 5 附录A (规范性附录)猪链球菌 2型快速检测程序猪链球菌 2型快速检测程序见图 A.1,可贬曲落P c R回 收 3 8 7 b y 片段、醉切、电 泳出 现 1 8 4饰、2 2 3 仰 片段结果翔断:分离菌为猪链球 菌 2 型图 A.1 猪链球菌 2型快速检测程序