GBT 19540-2004 饲料中玉米赤霉烯酮的测定.pdf

I CS 6 5.1 2 0B 4 6荡黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 4饲料中玉米赤霉烯酮的测定De t e r mi na t i on of z e ar a l e no ne i n f e e ds2 0 0 4-0 6-1 0 发布2 0 0 4-1 0-0 1 实施中华人民共和国国 家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 4I N舌 本标准参考国内外有关标准、文献，经研究、改进和验证后制定。本标准非等效于 A O AC(美国公职分析化学家协会)1 9 8 8年最后通过的玉米中玉米赤霉烯酮的薄层色谱法和 1 9 9 4 年首次通过的玉米、大麦、饲料中玉米赤霉烯酮的酶联免疫吸附测定法。其中薄层色谱测定方法为仲裁方法，酶联免疫吸附测定方法为快速筛选方法。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由江苏省微生物研究所负责起草。本标准主要起草人:毖晓黎、丁贵平、李利东、袁建兴、成恒篙.GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 4饲料中玉米赤霉烯酮的测定范围 本标准规定了玉米赤霉烯酮(z e a r a l e n o n e，以下简称 Z E N)的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测定法。本标准适用于配合饲料和饲用谷物原料中Z E N的测定。薄层色谱测定方法的最低检测量为 2 0 n g,酶联免疫吸附测定方法的最低检测量为。.2 5 n g,2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 1 4 6 9 9.1 怕料果样古洛薄层 色谱 法(仲裁法)3.1 原理 试样中Z E N用三氯甲烷提取，提取液经液一 液萃取、浓缩，然后进行薄层色谱分离，限量定量，或用薄层扫描仪测定荧光斑点的吸收值，外标法定量。3.2 试剂与材料 所用试剂除另有规定，均使用分析纯试剂水符合GB/T 6 6 8 2 中一级水的规定。3.2.1 三氯甲烷。3.2.2 4 0 g/L氢氧化钠溶液:称取 4g 氢氧化钠，加水适量溶解，用水稀释至1 0 0 m工。3.2.3 磷酸溶液(1+1 0).3.2.4 磷酸溶液(1+1 9)。3.2.5 无水硫酸钠:6 5 0 灼烧 4h，冷却后贮于干燥器中备用。3.2.6展开剂:三氛 甲烷一 丙酮一 苯一 乙酸(1 8+2+8+功。3.2.7 显色剂:2 0 g抓化铝(A I C 1,6 H2 0)溶于1 0 0 mL乙醇中3.2.8 薄层板:称取 4g 硅胶G,置于乳钵中加 1 0 m L 0.5 放甲基纤维素钠水溶液研磨至糊状。立即倒人薄层板涂布器内制备成 1 0 c mX2 0 c m、厚度。.3 mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板至前沿，吹干，标记方向，在 1 0 5 0C-1 1 0 活化 1h，置于干燥器内保存备用。3.2.9 Z E N标准储备溶液 普 告:工 凡接触 Z E N的容器，需浸人 4%次氯酸钠(N a O C I)溶液，半天后清洗备用。2 为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。称取适量的 Z E N标准品，用甲醇配制成约 1 0 0 p g/m L Z E N标准储备溶液。避光，于一5 以下储存。标定储备液的浓度，用 1 c m石英比色杯，以甲醇为参比，在 Z E N的最大吸收峰波长 3 1 4 n m处，测定吸光度值 A。储备液中Z E N的含量(X,)以微克每毫升(1 p g/mL)表示，按式(1)计算。GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 4X,A XM X 1 0 0 XS.一(1)式中:A-测定的吸光度值;M-Z E N的摩尔质量(M=3 1 8 g/mo l);e-Z E N在甲醇中的分子吸收系数(e=6 0 0 m /m o D;S 比色杯的光径长度，单位为厘米(c m),3.2.1 0 Z E N标准工作溶液:根据计算的标准储备液的浓度，精密吸取标准储备液(3.2.9)适量，用三氯甲烷稀释成浓度为 2 0 p g/m L的标准工作溶液3.3 仪器与设备3.3.1 小型粉碎机3.3.2 电动振荡器。3.3.3 薄层板涂布器。3.3.4 玻璃器皿:分液漏斗、漏斗。所有玻璃器皿均用稀盐酸浸泡，依次用自 来水、蒸馏水冲洗。3.3.5 旋转蒸发器:配有 2 0 0 m l心形瓶。3.3.6 慢速滤纸。3.3.7 展开槽;2 5 0 m m X1 5 0 m m X5 0 mm(立式，具磨口)。3.3.8 点样器:1 lc L-9 9 k L.3.3.9 紫外光灯:波长 2 5 4 n m,3 6 5 nn,3.3.1 0 薄层色谱扫描仪:配有汞灯光源3.4 试样制备 按G B/T 1 4 6 9 9.1 饲料采样方法取得试样，四分法浓缩减取约2 0 0 g，经粉碎，混匀，装人磨口瓶中备用。3.5 分析步骤3.5.1 试样 处理 称取约 2 0 g 试样(3.4)(精确至0.0 1 g),置于具塞锥形瓶中，加人 8 mL水和 1 0 0 mL三氯甲烷，盖紧瓶塞，在振荡器上振荡1h，加入 1 0g 无水硫酸钠，混匀，过滤，量取5 0 m L滤液于分液漏斗中，沿管壁慢慢地加人氢氧化钠溶液(3.2.2)1 0 mL，并轻轻转动 1 min，静置使分层，将三抓甲烷相转移至第二个分液漏斗中，用氢氧化钠溶液(3.2.2)1 0 mL，重复提取 1 次，并轻轻转动 1 m i n，弃去三氯甲烷层，氢氧化钠溶液层并人原分液漏斗中，用少量蒸馏水淋洗第二个分液漏斗，洗液倒人原分液漏斗中，再用 5 mL三氯甲烷重复洗 2 次，弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠溶液层中加人 6 ML磷酸溶液(3.2.3)后，再用磷酸溶液(3.2.4)调节 p H值至9.5 左右，于分液漏斗中加人 1 5 m l三氯甲烷，振摇，将三氯甲烷层经盛有约 5g 无水硫酸钠的慢速滤纸的漏斗中，滤于浓缩瓶中，再用 1 5 mL三氯甲烷重复提取 2次，三氯甲烷层一并滤于浓缩瓶中，最后用少量三氯甲烷 淋洗滤器，洗液全部 并于浓缩瓶中，真空浓缩至小体积，将其全量转移至具塞试管中，在氮气流下蒸发至干，用 ZmL三氯甲烷溶解残渣。摇匀，供薄层色谱点样用。3.5.2 点样 在距薄层板下端 1.5 c m-2 c m的基线上，以1 c m的间距，用点样器依次点标准工作溶液(3.2.1 0)2.5 p L,5 p L,1 0 p L,2 0 p 1(相当于 5 0 n g,1 0 0 n g,2 0 0 n g,4 0 0 n g)和试样液(3.5.1)2 0 p L,3.5.3展开 将薄层板放人有展开剂(3.2.6)的展开槽中，展至离原点 1 3 c m-1 5 c m处，取出，吹干。3.5.4观察与确证 将展开后的薄层板置于波长 2 5 4 n m紫外光灯下，观察与 Z E N(5 0 n g)标准点比移值相同处的试样的蓝绿色荧光点。若相同位置上未 出现荧光点，则试样中的 Z E N含量在本测定方法的最低检测量 2GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 45 0 0 F a g/k g 以下。如果相同位置上出现荧光点，用显色剂(3.2.7)对准各荧光点进行喷雾,1 3 0 加热5 mi n，然后在 3 6 5 n m紫外光灯下，观察荧光点由蓝绿色变为蓝紫色，且荧光强度明显加强，可确证试样中含有 Z E N。于荧光点下方用铅笔标记，待扫描定量测定。3.5.5定，测定3.5.5.1 薄层扫描工作条件 光源:高压汞灯。激发波长:3 1 3 n m;发射波长:4 0 0 n m,检测方式:反射。狭缝:可根据斑点大小进行调节。扫描方式:距齿扫描。3.5.5.2标准 曲线绘 制 以 Z E N标准工作溶液质量(n g)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。3.6 结果计算和表述 根据试样液荧光斑点峰面积积分值从标准曲线上查出对应的Z E N质量(n g)，试样中Z E N的含量(X)以微克每千克(p g/k g)表示，按(2)式计算。X二m,X 上 on o X V.，.。一(2)式中:V,试样液(3.5.1)最后定容体积，单位为微升(p L);V z 试样液点样体积，单位为微升(p L);m,从标准曲线上查得试样液点上对 应的Z E N质量，单位为纳克(n g);mo 最后提取液相当试样的质量，单位为克(9)。计算结果表示到小数点后一位有效数字。3.7 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于 1 0 0 0,4 酶联免疫吸附测定法(快速筛选法)4.1 原理 方法的检测依据是抗原一 抗体反应。将 Z E N抗体的羊抗体吸附在固相载体表面，加人 Z E N抗体、酶标 Z E N结合物、Z E N标准或试样液，在 Z E N抗体与固相载体表面羊抗体结合的同时，游离的 Z E N,酶标 Z E N结合物与结合在固体表面的Z E N抗体竞争，未结合的酶标 Z E N结合物洗涤除去。加人酶底物，在结合酶的催化作用下，无色底物降解产生蓝色物质。加入终止剂后颜色转变为黄色。通过酶标检测仪，在4 5 0 n m波长处测吸收值。吸光强度与试样中Z E N的浓度成反比。酶联免疫吸附测定法具有操作简单，快速灵敏，结果可靠的特点。目前有专门测定 Z E N的酶联免疫检测试剂盒的商品。在分析时适当参考操作说明书。4.2 试剂与材料4.2.1 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板2 4 孔或 4 8孔。4.2.2 7 0 写 的甲 醇溶液4.2.3 标准品溶液:精密吸取标定后的标准储备液(3.2.9)适量，用甲醇溶液(4.2.2)配制成 Z E N标准品溶液 1-5，浓度分别为 0 p g/L,5 p g/L,1 5 p g/L,4 5 p g/L,1 3 5 1,g/L.4.2.4 酶标抗原溶液:Z E N与辣根过氧化酶结合物。4.2.5 抗体溶液:抗 Z E N抗体。4.2.6 柠檬酸缓冲溶液 c(Na,C,;H;0,)=0.1 m o l/L,p H=4.0 :称取 1 0.1 4 7 1 g柠檬 酸钠GB/T 1 9 5 4 0-2 0 0 4(N a,C,H,0,2 H 2 0),1 3.7 6 4 2 g 柠檬酸(C,H,O,HB O)加水溶解至 1 L,4.2.7 底物溶液甲:四甲基联苯胺，用柠檬酸缓冲溶液(4.2.6)配成浓度为 0.4 g/L,4.2.8 底物溶液乙:取 1.5 mL 3 0%过氧化氢，用柠檬酸缓冲溶液(4.2.6)稀释至 1 L,4.2.9 底物溶液:底物溶液甲与底物溶液乙 1:1的混合液。4.2.1 0 终止液:硫酸溶液(1+1 7),4.3 仪器与设备4.3.1 酶标检测仪:带 4 5 0 n m波长。4.3.2 小型粉碎机。4.3.3 5 0 t L,1 0 0 K L,1 0 0 0 t L微量移液器。4.3.4 电动振荡器。4.3.5 玻璃器皿:5 0 m L锥形瓶、漏斗、量筒。4.3.6 快速滤纸。4.4 试样制备 同 3.4,4.5 分析步骤4.5.1 试样处理 称取约 5 g试样(4.4)(精确至0.0 1 g),置于5 0 m L具塞锥形瓶中，加人 2 5 mL甲醇溶液(4.2.2),密塞。振荡器提取 1 0 min e提取液通过快速滤纸过滤。取 1.0 mL滤液，加 1 9.0 mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。4.5.2 分析前注惫事项 分析前将所有试剂平衡至室温;分析后立即将所有试剂放回2 0C -8 冰箱;在所有培育中，避光，盖上微孔板盖。4.5.3定位 根据需要设定限量法(见表 1)和定量法(见表2)。取足够数量