GBT 4789.32-2002 食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测.pdf

I C S 0 7.1 0 0.3 0C 5 3r中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n f o r f o o d h y g i e n e r a p i d d e t e c t i o n o f c o l i f o r m b a c t e r i a2 0 0 2 一 0 6 一 1 3发布2 0 0 2 一 1 0 一 0 1实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布GB/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2目次前言 ”“.，.I引言 II1 范围 12 规范性引用文件 。”13 术语和定义 ，.“”“，.，.，”14 原理 ”，”15 试剂和培养基 ，.16 设备和器材 27 检验程序 ，”38 样品的制备 39 大肠菌 群的MP N计数 二31 0 大肠菌群的菌落计数 ，”4附录A(规范性附录)大肠菌群最可能数(MP N)检索表 5G s/T 4 7 8 9-3 2-2 0 0 2前言 本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验方法。本标准规定使用的培养基 MU G a l 肉汤中的4 一 甲基伞形 酮-(3-D 一 半乳 糖昔与 美国 联邦 法规4 0，第1 4 1 节，2 1 款(C o d e o f F e d e r a l R e g u l a t i o n s 4 0,P a r t1 4 1.2 1)规定的检验大肠菌群所用的M I 琼脂的主要成分(4 一 甲 基伞形酮一 件 D 一 半乳糖昔)是同一物质。本标准关于大肠菌群的菌落计数，参考了 I S O 4 8 3 2 c 1 9 9 1(EA微生物学大肠菌群菌落计数法通则(Mi c r o b i o l o g y-G e n e r a l g u i d a n c e f o r t h e e n u m e r a t i o n o f c o l if o r m s-c o l o n y c o u n t t e c h n i q u e),本标准中的附录A是规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准主要起草单位:镇江出人境检验检疫局、中国标准化协会、镇江质量技术监督局。本标准主要起草人:甄宏太、李平、张秀春A 继福。G a/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2引言 大肠菌群系指一群能发醉乳糖、产酸或醛，并产生 各 半乳糖昔酶需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。如果大肠菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。GB/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2食品卫生微生物学检验大肠菌群 的快速检测范围本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数。规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B 4 7 8 9.3 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定 GB 4 7 8 9.2 8 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 I S O 4 8 3 2:1 9 9 1(E)微生物学 大肠菌群菌落计数法通 则术语和定义 下列术语和定义适用于本标准3.1 大肠菌群c o l i f o r m b a c t e r i a 大肠菌群是革兰氏阴性、无芽抱、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐(或具有其他抑制生长的表面活性剂)存在的情况下生长，通常可在 3 6 士2 发酵乳糖并产酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解R-半乳糖昔、使培养基发出荧光或生成紫色(或红色)菌落的一群革兰氏阴性无芽抱杆菌。4原 理4.1 最可能数(MP N)法 大肠菌群可产生 各半乳糖昔酶，分解液体培养基中的酶底物4 一 甲基伞形酮一 各D 一 半乳糖普(以下简称MUG a D，使4 一 甲基伞形酮游离，因而，在波长 3 6 6 n m的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。4.2平板 法 大肠菌群可产生 件半乳糖昔酶，分解培养基中的酶底物茜素一 份D-半乳糖昔(以下简称 Al i z-g a l)，使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色(或红色)的 鳌合物，使菌落呈现相应 的颜色。试荆和培 养墓5.1 磷酸盐缓冲液 按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中3.2 2 规定进行制备。5.2生理盐水5.2.1 成分 氯化钠8.5 gG s/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2 蒸馏水1 0 0 0 m L5.2.2制法 将抓化钠溶于蒸馏水，1 2 1 C 蒸汽灭菌1 5 m i n,5.3 MUGa l肉汤5.3.1 成分 胰蛋白 陈或胰酪脉2 0.0 g 抓化钠5.0 g 无水磷酸氢二钾2.7 5 g 无水磷酸二氢钾2.7 5 g 月桂基硫酸钠。.1 g M U G.I(纯度不低于9 9%)0.0 8 g 蒸馏水1 0 0 0 mL5.3.2制法 将各成分加热溶于蒸馏水中，以1 5%2 0 肠氢氧化钠溶液调整p H值，分装于2 0 m m X 1 5 0 m m试管，每管 9 m L,1 1 6 C蒸汽灭菌 1 0 mi n，最终 p H值 7.0-7.2。待培养基冷却后，以无菌手续于每管培养液内加人0.1 mL经无菌水稀释的5 0 0 p g/mL头抱磺徒液或于 1 0 0 0 mL灭菌培养液内加 1 mL经无菌水稀释的5 m g/m L 头抱磺吮液并以无菌操作分装试管。注:双料 MU Ga l 肉汤除燕馏水外，其他成分加倍。5.4 A l i z-g a l 琼脂5.4.1 成分 胰蛋白脉或胰酪陈2 0.0 g 抓化钠5.0 g 无水磷酸氢二钾2.7 5 g 无水 磷酸二氢钾2.7 5 g 月 桂基硫酸钠。.1 g A l iz-g a l(纯度不低于9 7 写)0.0 5 g 异丙基硫代半乳糖昔。.0 3 g 硫酸 铝钾0.5 g 柠檬酸铁钱0.5 g 琼脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL5.4.2制法 将各成分放人蒸馏水中，加热使溶化，以1 5%2 0%N a O H调整p H值，分装烧瓶,1 1 6 0C 燕汽灭菌1 0 mi n，最终p H值 7.0-7.2,6 设 备和器材培养箱:3 7 士1 0C。冷藏箱:0 士4 C。天平:感量0.0 1 g均质器或乳钵。平皿:直径 9 0 mm,试管:2 0 m m X1 5 0 mm.吸管:1.0 ml 一 和 1 0.0 m L e月.门乙，口月-卜口了才 .朴U扣UU乃bCU产0UG B/T 4 7 8 9-3 2-2 0 0 2:;广口瓶或三角瓶:容量 5 0 0 mL玻璃珠:直径约 5 m m,试管架。紫外灯(波长 3 6 6 n m),其他。氏日刁.八2曰1月.月.检验程序行U内卜CU，产见 图 1 e图，检验程序8样品的制备8.1 以无菌手续取 2 5 mL(或 2 5 g)样品，加于含 2 2 5 mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的广口瓶(或三角瓶)内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇或用均质器以8 O O O r/m-1 0 0 0 0 r/m均质1 m i n 成1，1 0 稀释液。8.2 用 1 m L无菌吸管吸取 1，1 0 样品稀释液 1.0 m L，注人含 9.0 mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的试管内，振摇均匀，即成 1，1 0。样品稀释液。8.3 另取 1.0 m L无菌吸管，按上法制备 1 0倍递增样品稀释液。每递增一次，换一支 1.0 m L无菌吸管。8.4 根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三 管培养基(MP N 法)或两个平皿(平 板法)。9 大肠菌群的MP N计数9.1 将待检样品和样品稀释液接种MU Ga l 肉汤管，每管 1.0 mL(接种量在 1.0 m L以上者，接种双料MU G a l 肉汤管)。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种3管培养基。同时另取2支MUG a l肉汤管(或双料 MUG a l 肉汤管)加人与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)作空白对照。9.2 将接种后的 培养管置于3 T C 士 1 C 培养箱培养1 8 h-2 4 h,9.3 将培养管置于暗处，用波长 3 6 6 n m的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管;如未显GB/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。9.4 结果报告:根据大肠菌群阳 性管数，查M P N表(见附录A)，报告每1 0 0 m 工(g)食品中大肠菌群MP N值。1 0 大肠菌群的菌落计数1 0.1 用灭菌吸管吸取待检样液 1.0 mL，加人无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。1 0.2 于每个加样平皿内倾注 巧 mL 4 5 C 5 0 的 A i i z-g a l 琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀。待琼脂凝固后，再倾注3 m L-5 m L A l i z-g a l 琼 脂覆盖表面。同时 将A l iz-g a l 琼脂倾人加有 1 m L上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的无菌平皿内作空白对照。1 0.3 待琼脂凝固后，翻转平板，于 3 7 士1 C培养箱培养 1 8 h-2 4 h。取出平板，计数紫色(或红色)菌落。1 0.4 结果报告1 0-4.1 当平板上的紫色(或红色)菌落数不高于 1 5 0个，且其中至少有一个平板紫色(或红色)菌落不少于 1 5 个时，按式(1)计算大肠菌群数:公 了八=l ni十.,)a.一(1)式中:N样品的大肠菌群数，个/mL或 g;mc 所有计数平板上，紫色(或红色)菌落数之总和;n i 供计数的最低稀释倍数的平板数;n 2 供计数的高一稀释倍数的平板数;d 供计数的样品最低稀释度(如 1 0-,1。一 ,1 0-3 等)。1 0-4.2 如接种所有(3 个)稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于 1 5 个时，仍按式(1)计算，但应在所得结果旁加“”号，表示为估计值。1 0-4.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于 1 5 个时，报告结果为:每毫升(克)样品少于 1 5个大肠菌群。1 0-4.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色(或红色)菌落数时，报告结果为:每毫升(克)样品少于 1 个大肠菌群。1 0-4.5 如平板上的紫色(或红色)菌落数高于 1 5。个时，按式(1)计算，在结果旁加“，”号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。Gs/T 4 7 8 9-3 2-2 0 0 2 附录A (规范性附录)大肠菌 群最 可能数(MP N)检 索表表 A.1GB/T 4 7 8 9.3 2-2 0 0 2表 n.1(续)阳性管数MP N 1 0 0-L(g)9 5%可信限下 限上 限1-L(g)X30.1 mL(g)又30.0 1 mL(g)X322221111012巧O1 5 02 002 7 03 4 0:;:2222222201232 1 02 803 5 04 2 04 010 04701 500222233330123 一3 6 04 4 05 3 0一3333000001232 3 03 9 06 409 5 04