农业部2031号公告-11-2013 转基因植物及其产品成分检测 barstar基因定性PCR方法.pdf

农业部2031号公告一11一20137.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置3次平行。7.5.1.2在PR反应管中按表1依次加入反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加)。也可采用经验证的、等效的定性PC反应试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水一10XPCR缓冲液12.5L25mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5LdNTPs混合溶液（各2.5mmol/L)各0.2mmol/L2.0L10 umol/L barstar-F0.4 umol/L1.0L10 umol/L barstar-R0.4 umol/L1.0LTaq DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2 mg/L2.0L总体积25.0L“一”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0L。7.5.1.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s;然后，取出PCR管，放人PCR扩增仪中。7.5.1.4进行PR反应。反应程序为：94变性3min;94变性30s,58退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸5min。7.5.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以与试样相同种类的非转基因植物基因组DNA作为阴性对照；以含有barstar基因的质量分数为0.1%1.0%的转基因植物基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加人5LEB溶液，混匀。稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，放入1XTAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPCR产物与3L加样缓冲液混合后加人凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/c5V/cm条件下电泳检测。7.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。7.8PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。7.9PCR产物测序验证将回收的PC产物克隆测序，与转基因植物中转入的barstar基因序列（参见附录A)进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。3