农业部2031号公告-12-2013 转基因植物及其产品成分检测 Barnase基因定性PCR方法.pdf

农业部2031号公告一12-20135.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(5.5)和2ml.乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭南20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容至1000mL。使用时，用水稀释成1TAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解：称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚地区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为l0mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。5.12普通PCR引物：Barnase-F:5-GGGGTTGCGGATTATCTTC-3;Barnase-R:5-CCGTTGTTTTGTAAATCAGCC-3;预期扩增片段大小为276bp(参见附录A)。5.13实时荧光PCR引物和探针：qBarnase-F:5-AATCAGAAGCACAAGCCCTCG-3;gBarnase-R:5-AGTTTGCCTTCCCTGTTTGAGAA-3;qBarnase-P:5-TGTCTCCGCCGATGCTTTTCCCCG-3注：探针的5端标记荧光报告基团（如FAM,HEX等），3端标记荧光淬灭基团（如TAMRA、BHQ1等）。预期扩增片段大小为109bp(参见附录A)。5.14内标准基因引物：根据样品来源选择合适的内标准基因，确定对应的检测引物。5.15引物和探针溶液：用TE缓冲液(5.6)或水分别将上述引物和探针稀释到10umol/L。5.16石蜡油。5.17DNA提取试剂盒5.18定性PCR反应试剂盒。5.19实时荧光PCR反应试剂盒。5.20PCR产物回收试剂盒。6仪器和设备6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0。6.3荧光定量PCR仪。6.4电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.5紫外透射仪。6.6凝胶成像系统或照相系统。6.7重蒸馏水发生器或纯水仪。6.8其他相关仪器设备。7分析步骤7.1抽样2