农业农村部公告第111号-5-2018 转基因植物及其产品成分检测 抗虫水稻T2A-1及其衍生品种定性PCR方法.pdf

ICS65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业农村部公告第111号一5一2018转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻T2A-1及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for insect-resistant rice T2A-1and its derivates2018-12-19发布2019-06-01实施莺中华人民共和国农业农村部爱布农业农村部公告第111号一5一2018加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.3）直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液（见5.3）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HC)溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氮基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min.5.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（见5.5）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4）溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1TAE5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为l0mmol/L的dATP,dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁(MgCl2)溶液。5.12水稻内标准基因SPS基因引物（见农业部1861号公告一1一2012）SPS-F:5-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3;SPS-R:5-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3预期扩增片段大小287bp。5.13水稻内标准基因PEP基因引物（见农业部1861号公告一1一2012）PEPC-F:5-TCCCTCCAGAAGGTCTTTGTGTC-3;PEPC-R:5-GCTGGCAACTGGTTGGTAATG-3预期扩增片段大小为271bp。5.14T2A-1转化体特异性序列引物T2A-1-F:5-CCTCGTTTATTCCTGGTCATC-3;T2A-1-R:5-CCTTCTCTAGATCGGCGTTC-3预期扩增片段大小为183bp(参见附录A)。5.15引物溶液：用TE缓冲液（见5.6）或水分别将上述引物稀释到10mol/L。5.16石蜡油。5.17DNA提取试剂盒。5.18定性PCR试剂盒。5.19PCR产物回收试剂盒。6主要仪器和设备6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。