GBT 36812-2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法.pdf

GB/T36812-2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国福清出入境检验检疫局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：沈建国、蔡伟、高芳銮、张永江、陈细红、李敏、王宇、吴祖建、陈寿铃。GB/T3681220186抽样和样品制备6.1抽样尽量抽取有病毒危害症状的植物材料，PYDV的危害症状描述参见附录A;抽样方法按照SN/T2122中规定执行.6.2样品制备分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。7检测鉴定7.1RT-PCR检测以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录B。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。7.2实时荧光RT-PCR检测以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。8结果判定样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：一RT-PCR初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带PYDV;若检测结果为阳性，则采用PCR产物序列测定或实时荧光RT-PCR进行验证；若验证结果为阳性，则判定样品携带PYDV;若验证结果为阴性，则判定样品不携带PYDV。9样品保存与结果记录9.1样品保存经检测确定携带PYDV的样品应保存在适合的条件下以备复核。种苗、叶片等样品保存在一80冰箱中：做好登记和标记工作，保存期限至少1年。9.2结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片。2GB/T36812-2018附录A(资料性附录)马铃薯黄矮病毒相关资料A.1寄主范围已报道的寄主包括茄科、夹竹桃科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、蓼科和玄参科植物，主要自然寄主为马铃薯(Solanum tuberosum)。A2病害症状侵染马铃薯引起病株矮缩、黄化，茎的生长点早期坏死等症状（见图A1)。注：引自Cornell University,Bugwood.org。图A.1PYDV侵染马铃薯引起的症状A3分布地区主要分布于加拿大、美国。A.4传播途径主要经昆虫介体叶蝉Aceratagallia sanguinolenta、Aceratagallia sp.、Agallia constricta传播，也可通过带毒种薯、块茎远距离传播。A5粒体形态病毒粒体有包膜，杆菌状或子弹状，大小约380nm75nm。