GBT 5413.19-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 游离生物素的测定.pdf

G B/T 5 4 1 3-1 9-1 9 9 7前言 木标准等同采用美国公职分析化学师协会(AO A C)方法。木系列标准从实施之日 起，代替G B 5 4 1 3-8 5.木标准由中国轻工总会提出。木标准由全国乳品标准化中心归日。木标准负责起草单位:国家乳制品质量监督检验中心。木标准参加起草单位:卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻下业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司。木标准 主 要起 草人:张 玉杰、工 芸、杨 金宝。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准婴 幼 儿 配 方 食 品 和 乳 粉G B/T 5 4 1 3-1 9-1 9 9 7游 离 生 物 素 的 测 定代 甘 CB 5 4 1 3-8 5Mi l k p o w d e r a n d f o r m u la f o o d s f o r i n f a n t a n d y o u n g c h il d r e n -i l e 亩 e r mi n a t i o n o f f r e e b i o n i n c o n 宜 e n t1 范 围 木标准规定了用微生物法测定游离生物素的方法。木标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中游离生物素的测定。2 方 法原理 通过植物乳杆菌(肠d 汉.t。护 la:勿，.)生长情况来测定游离生物素含量。3 试 剂、菌种 和培 养基 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 生物素:标准品。3.2 乙醉:体积分数为5 0%.&3 菌种:植物乳杆菌(L a c t o b a c til l u s p la n to r u m).&4 培 养墓&4.1 乳酸杆菌琼脂培养基:光解陈I 殆，屏母浸青殆，荀萄钟I 飞，番茄汁 1 0 O.L,磷酸二氧钾跄，聚I I I梨糖单油酸酚Ig.琼脂I 飞，燕馏水1 0 O O mL,p H 6.8 士0.2(2 5)C).&4.2 乳酸杆菌肉汤培养基:光解陈l 5 g,醉母浸青殆，葡萄械l o g,番茄汁 l O O rn L.磷酸二氧钾翔，聚 h 梨械单油酸酷18,蒸馏水1 0 O O m L,p H 6.8 土 0.2(2 5 10.&4.3 生物素测定用培养基:维生素测定用酪蛋白氨基酸I 跑，浦萄糠4 9 g,乙酸钠2 0 g,L-耽氨酸0.饱,D L 一 色氨酸0.翱.硫酸腺1-1 吟2 0.g,盐敌鸟II I 吟2 0 m g,尿啥IQ 2 O Fn g,盐酸硫肢素2 m g,核黄素2-g.烟酸Z m g,泛酸钙2 mg,9酸毗哆N 7 2-g,p-氨墓笨p p 酸2 0 0 p g,5 4 酸氧二钾1 8,磷酸二氧钾I g,硫酸镁0.4 g,盆化钠2 0 rn g,硫酸亚铁2 0.g I 硫酸锰2 0 m g I 加蒸馏水至I 0 0 0,n L，p H 6.7 士0.1(2 5 C).4 仪 器 常用微生物实验室仪器及 p H训.5 制 备5.1 菌种的制备5.1.1 液体培养基的制备 吸取定量的墓础液体培养基，加入等里的燕馏水，舟个培养管分装I O.L I 盖上盖,1 2 1 灭菌1&n i n.迅速将灭菌管冷却，避免颜色形成。贮于冰箱中。国家 技术监 普 局 1 9 9 7-0 5-2 8 批准1 9 9 8-0 9-0 1 实施G B/T 5 4 1 1 1 9-1 9 9 75.1.2 植物乳杆菌(L.d.b-W-p I-i-)贮备管的制备 将所用的微生物菌种接种到2个以上琼脂培养塞试管内，在2 8-4 0 之间选择一 个恒定温度(士0.5,C)培养6-2 4 h,完成后放入冰箱。在使用新的菌种用于一个测定时，要在1-2周内做几个继代转接。不要用保存一周以上的培养基接种，培养基在保存过程中不要打开。5.1.3 接种的准备 将植物乳杆菌U-I o b a c tU u s p la n t a，二)(3.3)转接到一个无菌的I O.L液体培养基中，得到一个菌AU液。5.2 标准滚液的制备5.2.1 生物素标准贮备液:浓度5 体8 八L.精确称取5 0-6 0 rn g生物素标样(3.1)(从十操器中)，用乙醉(3.2)稀释，得到5 U/m L的生物素滚液，贮于冰箱中。5.2.2 生物A l 标准T 作液:浓度0.l n g/m L.吸 IML标准贮备液(5.2.1),用水稀释到I O o o mL I 再分别吸此稀释溶液各I ML，一个稀释到5 0 0 m L，作为高浓度标准溶液，一个稀释到I O o o m L，作为低浓度标准溶液.侮次现用现配。5.3 玻璃仪器的准备 使用焰状活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器IIIL进行洁洗(月桂磺敌钠.是一种合适的济洗剂)检验微生物对少数生长因了和许多清洗剂具有很高的敏感性，因此，清洗之后要求在2 5 0 十热条件下，加热1-2 h.6 操作 步骤6.1 样品的处理6.1.1+粉样品 精确称取一定星样品，该样品应含0.2-0.5 m 生物素。继续6.1.3步骤。6.1.2 液体样品 吸一定量的液体样品，该样品应含0.2-0.5.g生物素。继续6.1.3步绳。6.1.3 样品的提取 加水，使样品总体积为1 5 0,fi合后，M lmo l/L盐酸iA p H为4.5-4.6.定量转到2 5 O mL容量瓶中，用水定容，充分混合，川滤纸过滩，弃去最初的几毫刀，吸5.L滤液，用水定容到1 0 O.L.已2 标准曲线的制备 按表I 顺序加入燕馏水、标准溶液和维生素B 测定用培养基于培养管中，一式三份。表 I6.3iA It 1;No-一到 1 2 3 4XM*,.L 5 5 5 5牛 羹 6 7 1 801)试管 N o.3-7 中 加低浓 度标准济 液,N o.8-1 0 中 加高 浓度标 准溶液。沮 口 定液按表 2 顺 序加 燕馏水、样品溶 液 和维 生素 B 12 测 定用 培养基 于培 养 管内 一 式三 份。G B/T 5 4 1 1 1 9-1 9 9 7表 26.4火菌 直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入施环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀(灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响)。1 2 1 灭菌I O m in.6.5 接 种 无菌地接种侮个管，均加入一滴适当的接种物.除二I I I(或三4 1)中含有0.O m L标准溶液 未接种空白管)以外。盖上盖，充 分振荡混合所有管。6.6 培 养 在2 8-4 0 之间选祥一 个恒定温度(士0.5 1C),培养6 0-7 2 h.6.7 测定(酸度法)试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对侮个试管的视觉检六，进行反应预测.未接种管是清的.标准溶液和样品中应无其他微生物生长。6.7.1 滴定 用N it,6草阶蓝作指 J 剂，用0.I m-/L fAA化钠滴定1 4 个管中溶液.或以p H 6.8为电位滴定终点。如果接种空白滴定反应等于或高于未接种空白 水平的1.5 M L.则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.O.L的反应等于0.l m o l/L J E K化钠8-1 2.L的滴定度。6.7.2 测p H俏 试管被任何外来微生物污染则测定无效.通过对舟个试管的视觉检六 进行反应预测，未接种管是清的.标准溶液和样品中应无其他微生物生长。在培养之后读出管内容物的p H值，近似到0.O l p H谊单位。7 分析 结果 表述 样IVI中生物素的含i t.(P g/l o o g 或v g/1 0 0.L)=式中:X-梅毫升测定溶液中生物素含量的平 均价,m L j F-稀释 因了，.样品的质址或体积，.或毗。8 允许 差 同一样品两次侧定价之雄不得超过两次侧定平均仇的1 0%.轰 x 儡x 10 0 .(1 )