GBT 18649-2002 牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术.pdf

ICs11.220B41中华人民共和国国家标准GB/T18649-2002牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术Diagnostic techniques for contagious bovine pleuropneumonia2002-02-19发布2002-05-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布GB/T18649-2002前言牛肺疫是由丝状支原体丝状亚种(PG1)引起的一种牛属动物的传染病。健康牛和病牛接触由呼吸道吸入病牛的“飞沫”，是本病的主要传染方式和感染途径。暴发流行时多呈急性病演，呼吸系统症状非常明显，体温在41以上稻留。但在病的常在地区多见亚急性和慢性病程，以地方流行性为特点。急性期病变为浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎，肺间质多孔多汁，肺小叶出现各期肝变、多色，呈大理石样肺，肺胸膜和肋胸膜粘连，以及胸腔渗出液大量潴留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。慢性病牛长期带菌，成为隐蔽的传染源。在新发的地区对此病的检验应采取流行病学、临床学、血清学，病理学和病原学综合诊断方法为宜。世界动物卫生组织World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE于1986年和l992年推荐采用稍加改进的Campbell和Turner的补体结合试验作为牛肺疫血清学诊断的方法，但常出现非特异性反应。新中国成立后一直采用补体结合试验检验牛肺疫，并于1979年将该法列入农业部颁布的动物检疫操作规程中，但这种方法常出现1%2%非特异性反应。近年来我国研制成功了特异性高的微量凝集反应检验方法，它不但降低了非特异性反应率，而且操作简便，容易判定，应用效果良好。病原学诊断主要取病牛肺脏，胸腔渗出液和肺门淋巴结接种马丁培养基，即可分离出牛肺疫病原体，此法对急性期病例的检出率可达100%。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：白文彬。中华人民共和国国家标准GB/T18649-2002牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术Diagnostic techniques for contagious bovine pleuropneumonia1范围本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、补体结合试验、微量凝集试验诊断技术要求。本标准适用于牛传染性胸膜肺炎的检验。病原学检查适用于急性、亚急性及慢性病牛分离病原体，补体结合试验和微量凝集试验适用于牛肺疫抗体的检测。2病原学检查2.1材料准备培养基：10%马血清马丁肉汤，10%马血清马丁琼脂见附录A(标准的附录)。2.2病料采集22.1用灭菌器械（剪刀、镊子、吸管、青霉素瓶等）无菌采集肺脏、胸腔渗出液、肺门淋巴结，并将肺病料剪成3cm5cm方块。胸部淋巴结，以整个淋巴结为好，胸腔渗出液用吸管吸入青霉素瓶内。2.2.2受检病料的保存：肺和淋巴结保存在用茶色广口瓶盛装的灭菌的40%50%甘油生理盐水中，胸腔渗出液不加任何保存液。病料均放入冰箱内保存，并应尽快送往实验室检验。2.3培养方法在无菌条件下剪肺病料或淋巴结小块，用铂金耳钓人10%马血清马丁肉汤内；胸腔渗出液用灭菌吸管吸取0.1mL0.3mL接种于马丁肉汤中即可。同时取剪碎病料小块或直接取胸腔渗出液，用铂金耳在10%马血清马丁琼脂培养皿上划线接种，培养皿用胶布封口，置3738培养，每天观察一次，5d7d后判定.2.4结果判定2.4.1培养特征2.4.1.1培养性状和菌落形态：牛肺疫病原微生物在10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微混浊或呈白色点状、丝状生长，以后逐渐均匀混浊，半透明稍带乳光，不产生菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在10%马血清马丁琼脂培养皿上生长迟缓，为极小的水滴状圆形路带灰色的微细菌落，中央有乳头状突起。菌落直径约0.2mm0.5mm,小的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。2.4.1.2染色镜检取马丁肉汤培养物涂片放温箱中干燥，后在酒精灯上轻微火焰固定，再用3%5%铬酸蒸馏水溶液固定1min2min,水洗，浸人用蒸馏水稀释的1：30的姬姆萨氏染液中染色，染片时染色缸放人普通冰箱内过夜，染色后取出用蒸馏水轻洗，自然千燥后用8001000倍显微镜观察。菌形为多形态，以球点形最常见，大小在125nm250nm。2.4.2生化特性2.4.2.1糖发酵试验2.4.2.1.1取蛋白胨水(pH7.8一8.0)100mL,氯化钠0.5g所需各种糖类0.5g1.0g。溶解各成分，加人1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂0.1mL混匀，分装三分管内装2mL,管内装有倒置的小玻璃中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施GB/T18649-2002管（杜汉氏发酵管）。经106.4kPa20min灭菌。2.4.2.1.2在进行糖发酵试验时，首先将各种糖培养基小管加无菌的马血清0.2mL,再加受检的菌液0.1mL置3738下培养5d7d。2.4.2.1.3结果判定：牛肺疫菌可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉产酸使培养基变黄，而不产气：不能分解果糖、蔗糖、草糖、单奶糖和杨苷。2.4.2.2硫化氢(H2S)试验2.4.2.2.1乙酸铅纸条的制备：取滤纸剪成6.5cm0.6cm大小的纸条，置平皿中，经112kPa20min灭菌，烘干，再将滤纸条浸泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液(10g乙酸铅溶于50mL沸蒸馏水中，即为饱和乙酸铅溶液)，浸透后取出，置无菌平皿内，37烘于，保存于灭菌的试管中，2.4.2.2.2试验方法：受试菌接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上，取一片乙酸铅滤纸条，夹在试管的棉塞下悬挂，置37培养5d7d,滤纸条变黑或棕褐色者为阳性反应。2.4.2.3硝酸盐还原试验2.4,2.3.1培养基的准备：取营养肉汤或马丁肉汤100mL,硝酸钾(KN0,)0.1g,调pH至7.88.0，分装试验管，112kPa20min灭菌。2.4.2.3.2试剂的准备：试剂1，甲液：对氨基苯磺酸0.5g,5mol/L乙酸100mL:乙液：a-茶胺0.5g,5mol/几乙酸100mL.试剂2，二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。2.4.2.3.3试验方法。首先向硝酸盐培养液中加10%无菌马血清，然后将试验菌接种于硝酸盐培养基中，同时设不接种的对照管，于37培养5d7d。于5d和7d时取培养液少许放入干净的小试管中，再各滴一滴试剂甲液和乙液，对照管同样加试剂，若试管菌液呈现红色，橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加一二滴二苯胺试剂，若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在：如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质，则仍按硝酸盐还原试验阳性反应。2.4.2.4靛基质试验2.4.2.4.1培养基准备：蛋白胨1g,氯化钠0.5g,色氨酸0.1g,蒸馏水100mL。溶解各成分，调pH至7.88.0分装试管，经106.4kPa20min灭菌。24.2.4.2试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g,95%乙醇75mL,浓盐酸25mL。对二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中，再缓缓加人浓盐酸即成。2.4.2.4.3试验方法：先向培养基中加入10%无菌马血清，再将试验菌接种于培养基中，37培养5d7d后，滴加试剂数滴于培养物液面，轻轻摇动，红色为阳性反应。黄色为阴性反应。2.4.2.5甲基红(MR)试验2.4.2.5.1培养基：蛋白胨0.7g,葡萄糖0.5g,磷酸氢二钾0.5g,蒸馏水100mL。各成分溶解后，调pH7.88.0,分装试管。经106.4kPa20min灭菌备用。2.4.2.5.2试剂：甲基红0.02g,95%酒精60mL,蒸馏水40mL,先将甲基红研磨溶解于酒精中，再加蒸馏水即成。24.2.5.3试验方法：按10%量向培养基中加无菌马血清，再接种试验菌，37培养5d7d。于第五天时取少许培养液于另一支试管中，并加几滴试剂，如培养液呈现红色为MR试验阳性；黄色者为阴性，继续培养至第7天，再进行试验。2.4.2.6维培二氏(VP)试验2.4.2.6.1培养基与MR试验相同。2.42.6.2试剂与方法：可用下列三种试剂进行VP试验：a)Barritts试剂法。甲液：6%a-萘酚酒精溶液。乙液：40%氢氧化钾溶液。取MR试验的同一培养物约2mL,加甲液1mL,乙液0.4mL,充分混合，在5min内呈粉红色反应为阳性。2