GBT 18644-2002 猪囊尾蚴病诊断技术.pdf

1CS11.220B41中华人民共和国国家标准GB/T18644一2002猪囊尾蚴病诊断技术Diagnostic techniques for cysticercosis cellulosae2002-02-19发布2002-05-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布GB/T18644-2002前言猪囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)(俗称猪囊虫病)，是由寄生在人体小肠内的猪带绦虫(taeniasolium)的幼虫(cysticercus cellulosae)所引起的，是一种危害严重的人兽互源性寄生虫病。世界动物卫生组织World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE将该病列为B类疾病。目前，该病还广泛存在于发展中国家，不仅严重地影响着养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康，乃至生命。因此，1993年联合国卫生组织将该病列为需要根除的六大疾病之一。猪囊尾蚴病多不表现临床症状。目前，该病的检疫方法有舌检查法和免疫学检查法。前者仅适用于舌上寄生(27%30%)的病猪。后者包括皮内变态反应、炭粒凝集试验，间接红细胞凝集试验，补体结合反应、琼脂扩散试验、免狡电泳和酶联免疫吸附试验(ELISA)等等。其中，ELISA法具有高敏感性和特异性，是最常用的一种方法。本标准从病原分离、鉴定和血清学(ELISA方法)两方面规定了猪囊尾蚴病检查方法，结果更为可靠。本标准规定的ELISA法，适用于感染猪的定性，最早可以检出感染9天的囊尾蚴病猪。也适用于免疫猪群抗体水平的评估。本标准的附录A为标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：韩宇、姜秀云，赵权。中华人民共和国国家标准猪囊尾蚴病诊断技术GB/T18644-2002Diagnostic techniques for cysticercosis cellulosae1范围本标准规定了猪囊尾蚴病的病原分离与鉴定和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种诊断技术。本标准适用于猪囊尾蚴病的诊断和流行病学调查以及检疫。2病原分离与鉴定2.1病原分离2.1.1样品采集采集猪的咬肌、舌肌、内腰肌、膈肌、肋间肌、肩胛肌等，亦可采集脑、心脏、肝脏、肺脏等。2.1.2样品分离成熟的猪囊尾蚴为长椭圆形(6mm10mm)5mm,半透明的瘦壁内充满液体，上有一个黍粒大小的白色小结节即为头节(scolex)和颈节(neck)。脑内寄生的则为圆球形8mml0mm。将上述任何部位的囊尾蚴，以手术刀和镊子剥离后，以生理盐水洗净，并用滤纸吸干。2.2病原鉴定2.2.1分离样品的压片制备以剪刀剪开囊壁，取出完整的头节，再以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片，于两张载玻片间加人1一2滴生理盐水后置于显微镜下镜检。2.2.2镜检以低倍（物镜8倍、目镜5倍）观察囊尾蚴头节的完整性。2.2.3结果判定低倍镜检，可见到头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘，即判为猪囊尾蚴。3酶联免疫吸附试验(ELISA)3.1材料准备3.1.1器材ELISA反应板、酶联免疫检测仪、加样器、洗瓶、10cm1cm普通滤纸条等。3.1.2试剂猪囊尾蚴层析抗原，葡萄球菌A蛋白(SPA)辣根过氧化物酶(HRP)标记物(HRP-SPA)、猪囊尾蚴标准阴性和阳性全血滤纸片等。3.1.3被检猪全血血片将10cm1cm普通滤纸条的一端标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液12滴，于室内阴于后，置于4冰箱内（可保存6个月）。3.1.4溶液配制中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施1GB/T18644-2002溶液配制的方法见附录A(标准的附录)。3.2操作方法3.2.1抗原包被3.2.1.1首先以抗原包被液（见附录A中A1)洗涤ELISA反应板各孔三次。3.2.1.2以抗原包被液将抗原按使用说明书稀释至工作浓度。3.2.1.3用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔内，每孔0.1mL,加盏后置于室温(1129)过夜。注：包被过夜的ELISA反应板加盖后置于冰箱冷冻室内（可保存6个月）.或将包被过夜的ELISA反应板按3.2.2方法洗涤后，晾干，装入塑料袋内密封，置于4冰箱内（可保存4个月）。3.2.2洗涤用力甩净包被过夜的ELISA反应板孔内的抗原包被液，每孔加入洗涤液（见附录A中A2),浸泡3mi后，用力甩去洗涤液，并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加入洗涤液，按同样方法共洗涤3次，即33min冲洗。3.2.3血片的处理将被检血片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1cm1cm大小，分别置于青霉素瓶内，每1cm1cm血片加人稀释液（见附录A中A2)0.3mL,浸泡20min,即血片变白后即可。3.2.4加样3.2.4.1每份被检血片浸液加两孔，每孔0.1mL。3.2.4.2标准阴性、标准阳性对照孔加相应血片浸液两孔，每孔0.1mL。3.2.4.3空白对照孔加稀释液两孔，每孔0.1mL。3.2.4.4加样后加盖，于室温(1129)放置30min。3.2.5洗涤方法同3.2.2。3.2.6加酶标记SPA3.26.1HRP-SPA标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。3.2.6.2被检孔、标准阴性孔和标准阳性孔每孔加HRP-SPA标记物0.1mL。3.2.6.3空白对照孔亦加0.1mL。3.2.6.4加完后加盖，于室温(1129)放置30min。3.2.7洗涤方法同3.2.2。3.2.8加底物每孔加现配制的底物溶液（见附录A中A3)0.1mL,于室温(1129）放置10.min。3.2.9终止反应每孔加终止液（见附录A中A4)2滴，以终止反应。3.3判定在对照孔成立的前提下，即在标准阳性孔呈深黄色，标准阴性孔呈无色或浅黄色，空白孔呈无色，判定检测结果。3.3.1目测判定与标准阴性孔相比，颜色深于标准阴性孔者，即判定为ELISA法阳性病猪(+)。3.3.2酶联免疫检测仪判定(490nm)以空白对照孔调零，测定被检孔透光(OD)值。当OD0.22，判定为ELISA法阴性（一）：当OD0.26,判定为ELISA法阳性(+)：当0.23OD0.25，判定为ELISA法疑似（），疑似者复检一次，仍为疑似则判为阳性。2GB/T18644一2002附录A(标准的附录)溶液配制A1抗原包被液（碳酸盐缓冲液，pH9.6)B,碳酸钠(NaCO,)3.18g蒸馏水300mLC:碳酸氢钠(NaHCO,)5.86g蒸馏水700mlB、C两液混合即为抗原包被液，测pH(现用现配)。A2稀释液（吐温-磷酸盐缓冲液，pH7.4)B:磷酸氢二钠(Na:HPO412HO)14.5g蒸馏水202.5mLC:磷酸二氢钠(NaH2PO,2H,O)0.14g蒸馏水47.5mLB,C两液混合后，加氯化钠(NaCl)19g和少许蒸馏水，溶解后加蒸馏水至2500mL,然后再加人吐温-20(Tween-20)1.25mL,即为稀释液，测pH(现用现配)。该试剂既是被检猪抗体的稀释液，又是洗涤液。A3底物溶液（磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0)B:柠蒙酸（无水）0.96g蒸馏水50 mLC:磷酸氢二钠(Na2HPO,12H,O)3.50g蒸馏水50 mL取B液24.3mL、C液25.7mL和蒸馏水50mL,混合后加邻苯二胺0.04g,避光溶解后，加30%过氧化氢(Hz02)0.45mL,混匀后立即使用。A4终止液C2mol/L疏酸(HS0,)门蒸馏水177.8mL浓硫酸(96%98%)22.2mL混匀即可。