GBT 18397-2001 复合预混合饲料中泛酸的测定 高效液相色谱法.pdf

G B/r 1 8 3 9 7-2 0 0 1前言 复合预混合饲料中泛酸的测定，目 前尚无国际标准可依，本标准是在查阅国内外文献的基础上，参考 美国全国饲料协会(N F I A)分析方法概要 报导的方法“高效液相色谱方法测定液体和固体多种维生素添加剂中抗坏血酸、烟酸、烟酞胺、泛酸钙和泛醇的含量”而制定的。本标准在技术内容上参考国外方法，其方法原理相同;对范围、试样提取条件、称样量、高效液相色谱测定条件进行了改进，并做了明确规定。该法简便、快速、准确。本标准由 全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人:陈必芳、李兰。中 华 人 民共 和 国 国 家 标 准复合预混合饲料中泛酸的测定 高效液相色谱法G B/T 1 8 3 9 7-2 0 0 1D e t e r m i n a t i o n o f p a n t o t h e n i c a c i d i n c o mp o u n d p r e mi x-Hi g h-p r e s s u r e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y1 范围本标准规定了用高效液相色谱仪测定复合预混合饲料中泛酸含量的方法。本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中泛酸的测定，也适用于浓缩饲料中泛酸的测定，测量范围为每千克样品中含泛酸在5 0 m g 以上。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理试样中的泛酸经水提取，用磷酸缓冲液(p H 5.5)通过高效液相色谱C,，柱进行分离，用紫外检测器在2 0 0 n m处外标法进行定量测定。4 试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为去离子水，应符合G B/T 6 6 8 2 三级用水的规定。4.1 0.1%磷酸溶液。4.2 1 写乙二胺四乙酸二钠(E D T A)溶液。4.3 磷酸缓冲液:称取 3.1 2 g二水磷酸二氢钠(N a H i 1 0,2 1-1 2 0)溶于 1 L水中，用氢氧化钠溶液c(N a O H)=0.1 m o l/L调节至p H 5.5，通过0.4 5 p m滤膜过滤脱气备用。4.4 泛酸(或泛酸钙)标准溶液。4.4.1 泛酸(或泛酸钙)标准储备液:准确称取已 知纯度的D 一 泛酸(或D-泛酸钙)标准纯品0.0 2 0 0 g,置于1 0 0 m l棕色容量瓶中，用。.I%磷酸溶液(4.1)溶解、定容至刻度，摇匀。4.4.2 泛酸(或泛酸钙)标准工作液:精密吸取标准储备液(4.4.1)用水按 1:1 0比例稀释，现用现配该 溶液浓度为 每毫升含D-泛酸(或D 一 泛酸 钙)2 0 p g,4.5 氢氧化钠溶液:c(N a O H)=1 m o l/L.4.6 盐酸溶液:c(H C I)二1 m o l/L o5 仪器设备5 门实验室常用仪器设备。中华人民共和国国家质f监份检验检疫总局 2 0 0 1 一 0 7-2 0批准2 0 0 1 一 1 2 一 0 1实施G s/r 1 8 3 9 7-2 0 0 15.2 p H计。5.3 超声波水浴。5.4 超纯水装置(Mi l l i p o r e 或全磨口玻璃蒸馏器)。5.5 离心机:3 0 0 0 r/m i n,5.6 高效液相色潜仪:带自动进样器，紫外检测器。6 试样制备 选取有代表性的样品至少5 0 0 g，四分法缩减至1 0 0 g,磨碎，全部通过。.2 8 m m孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。7 分析步骤7.1 试验溶液的制备7.1.1 复合预A合饲料:称取试样1 -2 g 或维生素预混合饲料0.2 5-0.5 g,精确至。.0 0 0 1 g，置于1 0 0 m L棕色容量瓶中。加6 0 m L水浸湿，摇匀，加1 0 m L l%二乙胺四乙酸二钠溶液(4-2)混匀，置于超声波水浴上振荡提取1 5 m i n。用水定容至刻度混合均匀。过滤或离心。再经0.4 5 1,m过滤膜过滤，调整溶液的浓度大于1 p g/m L，供高效液相色谱分析用。7 门 2 浓缩饲料:称取试样2-5 g,精确至0.0 0 0 1 g,置于1 0 0 m L棕色容量瓶中。加6 0 m L 水浸湿，摇匀，加1 0 m L l%二乙胺四乙酸二钠溶液棍匀，置于超声波水浴上振裁提取1 5 m i n。提取液若出现混浊，需用几滴氢氧化钠溶液(4-5)和盐酸溶液(4-6)调节p H至4.5 左右，至溶液澄清(用试纸显示)沉淀蛋白质，用水定容至刻度，以下步骤同7.1.1,注:当 浓缩饲料每千克样品中泛酸含量低于5 0 m g 时，可增加称样量.7.2 测定7.2.1 色谱条件 固定相:O D S(C,a)粒度5 p m。柱长1 5 0 m m、内径3.9 m m不锈钢柱。移动相:磷酸缓冲液(4.3),流速:1.0 m L/m i n 温度:室温。进样量:1 0 2 0 可 一 检测器:紫外检测器(或二极管矩阵检测器P D A)使用波长 2 0 0 nn,7.2.2 定量测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度(A U F S)，色谱峰分离符合要求。用两次以上相应标准工作液对系统进行校正，向色谱柱注入相应的泛酸或泛酸钙的标准工作液 4.4.2(V s t)和试验溶液 7.1(V i)得到色谱峰面积响应值(P s t,P i)，用外标法定量测定。8 结果的计抹与裹述8.1式 中计算公式复合预混合饲料中泛酸的含量按式(1)计算:P,XVXP;XV XfP 又 m 沐V，.(1)咔一每千克试样中泛酸的含量,m g;一 试 样质 量+g;V 一一提取液的总体积，m l;N 一一泛酸(或泛酸钙)标准工作液浓度，u g/m L;G B/r 1 8 3 9 7-2 0 0 1 v 一泛酸(或泛酸钙)标准工作液进样体积，k L;v一 一 从试验溶液中分取的进样体积，k L;P一 一 与标准工作液进样体积(V I I)相应的峰面积响应值;P,一 一 与从试验溶液中分取的进样体积(V;)相应的峰面积响应值;f一 转换系数，用泛酸作标准物质时，系数为 1;用泛酸钙作为标准物质时转换成泛酸，系数为 0.9 2 0(1 m g 泛酸相当于1.0 8 7 m g 泛酸钙)。6.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留小数点后一位。9 允许差同 一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果相对偏差见表表 1每千克试样中泛酸含量.m g相对偏差。%5 0-2 0 0 0成士1 0 2 0 0 0镇 士5.0