GBT 14926.8-2001 实验动物 支原体检测方法.pdf

I C S 6 5.0 2 0.3 0B 4 4臀鹭中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6.1 一1 4 9 2 6.6-2 0 0 1.8-1 4 9 2 6-1 7-2 0 0 1.4 1-2 0 0 1.4 4 一 1 4 9 2 6.4 9-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(2)L a b o r a t o r y a n i m a l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n m e t h o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9 发布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布目录1.刁0门白咋才1尸刁门斗0口口户卜州J峪009户6Q八j洲门乃7曰 11n几八八八乃八JA占八峪叹UL门:Jhh户匕门了月了口U只QG B/T 1 4 9 2 6.1-2 0 0 1 实验动物沙门菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.2-2 0 0 1 实验动物单核细胞增生性李斯特杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.3-2 0 0 1 实验动物 耶尔 森菌检 测方法G B/T 1 4 9 2 6.4-2 0 0 1 实验动物皮肤病原真菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.5-2 0 0 1 实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.6-2 0 0 1 实验动物支气管鲍特杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 1 实验动物支原体检测方法 。GB/T 1 4 9 2 6.9-2 0 0 1 实验动物鼠棒状杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.1 0-2 0 0 1 实验动物泰泽病原体检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 1-2 0 0 1 实验动物大肠埃希菌。1 1 5 a,c:K(B)检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.1 2-2 0 0 1 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 3-2 0 0 1 实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 4-2 0 0 1 实 验动物 金黄色葡萄球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 5-2 0 0 1 实 验动物 肺炎链球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 6-2 0 0 1 实验动物乙型溶血性链球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 7-2 0 0 1 实验动物绿脓杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 1-2 0 0 1 实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 4-2 0 0 1 实验动物念珠状链杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 5-2 0 0 1 实验动物布鲁杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 6-2 0 0 1 实验动物钩端螺旋体检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 7-2 0 0 1 实验动物志贺菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 8-2 0 0 1 实验动物结核分枝杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 9-2 0 0 1 实验动物空肠弯曲杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 1前言 本标准是对G B/T 1 4 9 2 6.8-1 9 9 4 实 验动物 肺支原体检验方法 的修订。本标准取消了用于支原体种鉴定的生长抑制试验，将盲传次数减至 1 次，增加 了E L I S A法作为初步检测的选用方法。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红。本标准于1 9 9 4 年 1 月首次发布。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标准GB/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 1实验动物支原体检测方法代替GB/T 1 4 9 2 6.8 一1 9 9 4L a b o r a t o r y a n i ma l-Me t h o d f o r e x a mi n a t i o n o f My c o p l a s ma s p.范 围本标准规定 了 实验动物支原体的检测方法本标准适用于小鼠、大鼠的支原体检测。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 1 4 9 2 6.4 2-2 0 0 1 实验动物细菌学检测标本采集 G B/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂 G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验3原理 对实验动物具有致病能力的支原体主要寄居其上呼吸道，支原体在半流体培养基和固体培养基上可形成特殊菌落，菌落可被D i e n e s 染色液染成蓝色而不褪色，据此可进行病原学鉴定。动物感染支原体后血清中可产生相应抗体，使用 E I A S A法可进行抗体检测，但由于动物 自然感染后血清抗体水平较低，亦有可能因与其他病原微生物存在共同抗原而导致的交叉反应，故血清学方法仅作为初步检测的选用方法。4 主要设备和材料4.1 普通恒温培养箱。4.2 实体显微镜。4.3 蜗旋混匀器。4.4 毛细吸管，每份样品 I 支4.5 恒温水浴箱。4.6 高速离心机。4.7 超声波细胞粉碎器。4.8 酶标仪。4.9 聚苯乙烯板，4 0孔、5 5 孔或 9 6 孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，紫外光照射 1 h,4.1 0 微量加样器，容量 5 -5 0 K L和 5 0 2 0 0 p L5 培养基和试剂5.1 支原体半流体培养基。中华人民共和国国家质且监督检验检疫总局2 0 0 1 一 0 8-2 9 批准2 0 0 2一 0 5 一 0 1实施 GB/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 152 支原体液体培养基。5.3 支原体固体培养基。5.4 D i e n e s 染色液。5.5 E LI S A 抗原5.5.1 支原体培养:肺支原体、关节支原体和溶神经支原体标准株接种支原体液体培养基，3 6 C 摇动培养 2-3 d,5.5.2 已明显混浊的培养液按 8 0 0 0 r/m i n离心 3 0 mi n，沉淀用 P B S在相同条件下洗 3 次。5.5.3 上述沉淀用 P B S悬浮，超声波打碎后.上清即为E L I S A抗原。5.6 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠I g G抗体，用于检M相应动物血清抗体;辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(S P A)，用于检测小鼠血清抗体。5.了阳性血清 支原体抗原免疫清洁级或 S P F级小鼠或大鼠所获得的抗血清。5.8 阴性血清 无支原体感染的清洁级或 S P F级小鼠和大鼠血清。5-9 其他试剂溶液的配制见G B/T 1 4 9 2 6.4 9-2 0 0 1 e6检测方法6.1 分离培养法61.1检测程序Gs/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 16.1.2 操作步骤6 门.2.1 采样 取包括咽部及以下气管约 5 -1 0 mm左右放人装有。.6-0.7 mL酵母浸液的试管中，用蜗旋混匀器制成洗脱液。6.12.2 分离培养 按G1 3/T 1 4 9 2 6.4 2-2 0 0 1 4.1 8 进行接种后放(3 6 士1)培养箱培养。6.1.2.3 鉴定 a)支原体在半流体培养基中经 3 -7 d培养，在培养基的上部可形成小的慧星状、云雾状或沙粒状菌落。b)吸取含可疑菌落的半流体培养物约。.5 mL转种支原体液体培养基，(3 6 士1)C 培养5-7 d,吸取该培养物约。.1 m L接种于支原体固体培养基，用I 一 棒涂抹均匀，待表面干后将培养基放人保鲜袋，2 8G B/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 1密闭，(3 6 士1)c 培养。c)支原体在固体培养基培养3-7 d 后可形成“煎蛋状，或“杨墓状”菌落。d)染色:将有可疑菌落的固体培养基平皿进行 D ie n e s 染色，3 0 mi n或更长时间后支原体菌落依然为蓝色，而细菌 L型菌落则变为无色。e)如初代半流体培养 7 d无可疑菌落出现，应吸取约 1/1 0的初代培养基接种于相同培养基进行盲传，经(3 6 士1)C培养 7d，如仍无可疑菌落出现则判定为阴性;对出现可疑菌落者则按照“b),c),d)”步骤进行鉴定6.2 酶联免疫吸附试验(E L I S A)6.21 包被抗 原 根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。每孔1 0 0 I.L,置3 7 C 1 h 后再4 过夜。6.2.2 用洗涤液洗 5 次，每次 3 m i n,叩千。6.2.3 加样 待检血清和阴性、阳 性血清分别用稀释液做I，4 0 稀释，每孔1 0 0 爪,3 7 C 1 h，洗涤同上。6.2.4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加人 1 0 0 1,L,3 7 0C 1 h，洗涤同上。6.2-5 加底物溶液 每孔加人新配制的底物溶液 1 0 0 k L，置 3 7 C,避光显色 1 0.1 5 m i n,6-2-6 终止反应 每孔加人终止液5 0 rL L,6.2-7 测 A值 在酶标仪上，于 4 9 0 n m处读出各孔 A值6.2.8 结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。6.2.8.1 同时符合下列 2 个条件者，判为阳性。a)待检血清的A值乒0.2;b)待检血清的A值/阴 性对照血清的A值异2.1 06.2-8.2 均不符合上述 2 个条件者，判为阴性。6.2-8.3 仅有 1 条符合者，判为可疑，需重试。6.2-8-4 对阳性结果需重试，如为阳性则判为阳性。7结果报告 E L I S A法结果阳性者应抽取相同动物群动物进行支原体分离培养，符合上述培养、染色特征者作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。