GBT 17816-1999 饲料中总抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法.pdf

GB/r 1 7 8 1 6-1 9 9 9前言 本标准参考了美国公职分析化学家协会A O A C(1 9 9 5 年版)4 5.1.1 4-4 5.1.1 6 维生素制品和果汁中的维生素C 、维生素制品中的维生素C 和 食品中的总维生素C 的规定，在技术内容上，综合上述三种方法，在操作步骤上作了相应的 变更，以便于实际操作。本标准由 全国 饲料工业标准化技术委员会提出 并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(武汉)负责起草。本标准主要起草人;屈利文、钱肪。中华 人民共和 国国家标 准饲料中总抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法G B/T 1 7 8 1 6-1 9 9 9De t e r mi n a t i o n o f t o t a l a s c o r b i c a c i d i n f e e d s-o-P h e n y l e n e d i a mi n e f l u o r o me t r y1 范围本标准规定了用邻苯二胺荧光法测定饲料中总抗坏血酸的方法。本标准适用于单一饲料、配合饲料、预混料及浓缩饲料。不适用以酷化抗坏血酸形式添加的各种饲料中抗坏血酸的测定。在 最终 提取液中 抗坏血酸 最小检出限为。.0 2 2 p g/m L.2 q 1 用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理 先将试样中抗坏血酸在弱酸性条件下提取出来，提取液中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，与邻苯二胺(O P D A)反应生成有荧光的哇呢琳(q u i n o x a l i n e)，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比。另外，根据脱氢抗坏血酸与硼酸可形成硼酸一 脱氢抗坏血酸络合物而不与邻苯二胺反应，以此作为“空白”排除试样中荧光杂质的干扰。4 试剂 本标准所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。实验室用水应符合G B/丁6 6 8 2 中三级水的规格。4 门偏磷酸一 乙酸溶液:称取1 5 g 偏磷酸，加入4 0 m L冰乙酸及2 5 0 m L水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至5 0 0 m L。于4 C 冰箱可保存7-1 0 天。4.2 0.1 5 m o l/L硫酸溶液:取1 0 m L硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1 2 0 0 m L.4.3 偏磷酸一 乙酸一 硫酸溶液:以0.1 5 m o l/L硫酸溶液(4-2)为稀释液代替水，其余同4.1 配制4.4 5 0%乙酸钠溶液:称取 5 0 0 g 乙酸钠(C H,C O O N a 3 H,O)，加水至1 0 0 0 m L.4.5 硼酸一 乙酸钠溶液:称取3 g 硼酸，溶于1 0 0 m L乙酸钠溶液(4-4)中。临用前配制。4.6 邻苯二 胺溶液:称取2 0 m g 邻苯二胺，于临用 前用水稀释至l o o M I4.7 抗坏血酸标准溶液(1 m g/m L):准确称取5 0 m g 杭坏血酸，用溶液(4.1)溶于5 0 m I容量瓶中，并稀释至刻度。临用前配制。4.8 抗坏血酸标准工作溶液(1 0 0 p g/m L):取 1 0 m L抗坏血酸标准溶液(4.7)，用溶液(4.1)稀释至国家质f技术监督局1 9 9 9 一 0 8 一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 2 一 0 1 实施G s/T 1 7 8 1 6-1 9 9 91 0 0 m l 稀释前测试p H值，如其p H大于2.2 时，则应用溶液(4-3)稀释。4.9 0.0 4%百里酚蓝指示剂溶液:称取。.1 g 百里酚蓝，加。.0 2 m o l/1氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量为1 0.7 5 m L，磨溶后用水稀释至2 5 0 m L 变色范围:p H值等于1.2 为红色;p H值等于2.8 为黄色;p H值大于4.。为蓝色。4.1 0 活性炭的活化:加2 0 0 g 炭粉于1 L盐酸(1+9)中，加热回流1-2 h，过滤 用水洗至无铁离子(F e)为止，者于1 1 0 -1 2 0 C 烘箱中干燥，备用。检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。5 仪器、设备荧光分光光度计:激发波长3 5 0 n m，发射波长4 3 0 n m,l c m石英比 色皿。实验室用样品粉碎机。实验室常用仪器、设备5152536 试样制备取具有代表性样品，用四分法缩分至2 0 0 g，然后粉碎至过。.4 5 m m(4。目)筛，混匀后装于密封容器，保存备用。7 测定步骤了.1 试样中碱性物质量的预检 称取试样1 g 于烧杯中，加1 0 m L 偏磷酸一 乙酸溶液(4-1)，用百里酚蓝指示剂检查p H值 如呈红色，即可用偏磷酸一 乙 酸溶液作样品提取稀释液。若呈黄色或蓝色，则 滴加偏磷酸一 乙 酸一 硫酸溶液(4.3),使其变红，并记录所用量7.2 试样溶液的制备 称取试样若干克(精确至。0 0 0 1 g，含抗坏血酸约2.5 1 0 m g)于1 0 0 m L 容量瓶中，按7.1 预检碱量，加偏磷酸一 乙酸一 硫酸溶液(4.3)调至p H为1.2，或者直接用偏磷酸一 乙酸溶液(4-1)定容，摇匀。如样品含大量悬浮物，则需进行过滤，滤液为试样溶液。7.3 测定步骤7.11 氧化处理:分别取上述试样溶液(7-2)及标准工作溶液(4.8)1 0 0 m L于2 0 0 m L带盖三角瓶中，加2 g 活 性炭(4.1 0)，用力振摇1 m i n，干法过滤，弃去最初数毫升，收集其余全部滤液，即为样品氧化液和标准氧化液7.3.2 各取 1 0 m L标准氧化液于两个1 0 0 m L容量瓶中分别标明“标准”及“标准空白”。7.3.3 各取 1 0 m l样品氧化液于两个 1 0 0 m L容量瓶中分别标明“样品”及“样品空白”7.3.4 于“标准空白”及“样品空白”溶液中各加5 m L 硼酸一 乙 酸钠溶液(4.5),混合摇动1 5 m i n，用水稀释至1 0 0 m L7.3.5-F“标准”及“样品”溶液中各加5 m L乙酸钠溶液(4-4)，用水稀释至1 0 0 m L,7.3.6 荧光 反应:取7.3.4 中“标准空白”、“样品空白，溶液及7.3.5 中“样品”溶液2.0 m L，分别置于1 0 m l 带盖试管中在暗室迅速向各管中加人 5 m L邻苯二胺溶液(4.6)，振摇混合，在室温下反应3 5 m i n,-F 激发波长3 5 0 n m，发射波长4 3 0 n m处测定荧光强度。7.3.7 标 准曲 线的 绘制:取上 述“标准”溶液(7-3-5)(抗坏血酸含量1 0 p g/m L)0.5,1.0,1.5 和2.0 ml-标准系列，各双份分别置于1 0 m L带盖试管中，再用水补充至2.0 ml。荧光反应按7.3.6。以标准系列走 光7 1 t 度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应抗坏血酸含量(g)为横坐标，绘制标准曲线G s/T 1 7 8 1 6-1 9 9 98 分析结果的计算及表示 分析结果按式(1)计算丝m 一-X式中:x 一每干 克试样中含 抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总量,m g;C 一 一从标准曲线上查得的试样液中抗坏血酸的含量,k g;。，试样质量,9;n 试祥溶液的稀释倍数.所得结果表示到小数点后一位。9 允许差 每个试样称取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。在侮千克饲料中 抗坏血酸的含量小于或等于1 0 0 0 m g 时，测定结果的相对偏差不大于i o 0 0 在每千克 饲料中抗坏血酸的含量大于1 0 0 0 m g 时，测定结果的相对偏差不大于,S 0 u