GBT 18625-2002 茶中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法 酶抑制法.pdf

i c s 6 7-0 4 0.1 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 8 6 2 5-2 0 0 2茶中有机磷及氨基甲酸醋农药残留量的简易检验方法酶抑制法Me t h o d f o r s i mp l e d e t e r m i n a t i o n o f o r g a n o p h o s p h o r u s a n dc a r b a ma t e p e s t i c i d e r e s i d u e s i n t e a-E n z y me i n h i b i t i o n me t h o d2 0 0 2 一 0 1 一 2 8 发布加 0 2 一 0 6 一 0 1实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布GB/T 1 8 6 2 5-2 0 0 2前言 本标准在制定过程中主要参考了以下标准:美国公职 分析化学师协会A O A C 1 2 2 9.0 4 9-2 9.0 5 5 食品中有机磷农药残留 测定 胆碱醋酶抑制法。本标准的附录 A是规范性附录。本标准由辽宁省质量技术监督局提出。本标准由沈阳农业大学、沈阳市质量技术监督局苏家屯分局负贵起草。本标准主要起草人:周艳明、高淑英、张会娟、王晓光、李亮亮、吴小琳、牛森。G B/r 1 8 6 2 5-2 0 0 2茶 中有机磷及氨基甲酸醋农药残留量的简易检验方法酶抑制法范围本标准规定了用酶抑制法测定茶中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留的简易检验方法。本标准适用于茶中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留的测定.2 原 理 有机磷农药及氨基甲酸醋类农药对胆碱酷酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农药种类及其含量。在p H8 的溶液中，碘化硫代乙酞胆碱被胆碱酷酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的 2,6 一 二氛靛酚褪色，褪色程度与胆碱醋酶活性正相关，可在 6 0 0 n m 比色测定，酶活性愈高时，吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸醋类农药存在时，酶活性受到抑制，吸光度值则较高。据此可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酷类农药的残留情况。样品提取液用氧化剂氧化，可提高某些有机磷农药的抑制率.因而可提高其测定灵敏度.过量的氧化剂再用还原剂还原，以免干扰 测定。试荆3.1 底物溶液:2%碘化硫代乙酞胆碱水溶液，1 g碘化硫代乙酞胆碱，加缓冲液溶解并定容至 5 0 mL,3.2 缓冲液 p H8 的三经甲基氨基甲烷(T r i s)-盐酸缓冲液,5 0 m L 0.1 mo l/L T r i s 加2 9.2 m L 0.1 mo l/L盐酸加水定容至 1 0 0 MI。3.3 显色剂:0.0 4%2,6 一 二氯靛酚水溶液。3.4 氧化剂:0.5%次抓酸钙水溶液。3.5 还原剂:1 0%亚硝酸钠水溶液。3.6 胆碱酷酶液:0.2 g酶粉(其制备方法见附录A)h p 1 0 m l，缓冲液溶解。3.7 脱色剂:活性炭。3.8 丙酮:分析纯。I9 碳酸钙:分析纯。仪器分光光度计。分 析步骤 样品提取取。.5 g茶置于 1 0 mL烧杯中。加 5 mL丙酮浸泡 5 min，不时振摇，再加。.2 g碳酸钙.注:以 上 操 作 应 存 1 5-3 5(ia彦 下 决 杆GB/T 1 8 6 2 5-2 0 0 25.2叙化 取0.5 mL丙酮提取液于 5 mL烧杯中，吹干后加 0.3 mL缓冲液溶解。加人氧化剂 0.1 mL，摇匀后放置 1 0 min。再加人还原剂 0.3 mL,摇匀。5.3 酶解 加人酶液 0.2 mL，摇匀，放置 1 0 mi n，再加人底物溶液。.2 mL，显色剂 0.1 mL，放置 5 mi n后测定。5.4 测定 分光光度计波长调至 6 0 0 n m，其他按常规操作，读取测定值。6 结果 测定结果的使用当测定值在 1.0以下时，为未检出。当测定值在 1.0-1.3 之间时，为可能检出，但残留量较低。当测定值为 1.3以上时，为检出。测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。方法最低检出浓度本方法最低检出浓度见表 1,表 1最低检出浓度单 位 为毫 克 每 千 克农 药最低检出浓度一最 低 检 出 浓 度敌 敌 畏2.0一1 0.0甲基 对 硫 磷3.0敌 百 虫2.0乐 果3.0氧 化 乐 果1.0辛 硫 碑3.01.5内 吸 碑1.020乙 酸 甲胺 磷2.0二 嘴 磷5.0峡 喃 丹4.0西 维 因2.0抗 蚜 威1.2Gs/T 1 8 6 2 5-2 0 0 2 附录A (规范性附录)胆碱醋酶 粉的制备A.1 试 荆A-1.1 0.1 m o l/L p H 6.0 磷酸缓冲液 0.1 mo l/L磷酸氢二钠溶液:1 7.5 6 g磷酸氢二钠(Na,HP O,2 H2 0)溶于 1 0 0 0 m L水中。0.1 mo l/L磷酸二氢钠溶液:1 3.8 0 g磷酸二氢钠(N a HZ P O,2 H O)溶于 1 0 0 0 mL水中。将 1 2.3 mL 0.1 mo l/L磷 酸氢二钠溶液与 8 7.7 mL 0.1 m o l/L磷酸二氢钠溶液混合，即为0.1 m o l/L p H 6.0 磷酸缓冲液。A.1.2 0.0 0 5 m o t/L p H 6.0磷酸缓冲液 取 5 0 mL 0.1 mo l/L p H6.0 磷酸缓冲液(A.1.1)，加水稀释至 1 0 0 0 m L,A.1.3 0.5 mo l/L氢妞化钠一 0.5 mo l/L旅化钠溶液 1.0 m o l/L氢氧化钠溶液:取4 0 g 氢氧 化钠溶于1 0 0 0 m L 水中。l.0 m o l/I氛化钠溶液:取5 8.5 g 氯化钠溶于1 0 0 0 m L水中。将上两液 1:1 混合，即得 0.5 m o l/L氢氧化钠-0.5 m o l/L抓化钠溶液。A.1.4 0.5 mo l/L盐酸-0.5 mo l/L抓化钠溶液 1.0 mo l/L盐酸溶液:取 8 3.3 3 mL浓盐酸溶于 1 0 0 0 m L水中。将 1.0 m o t/L盐酸溶液与 1.0 m o l/L氯化钠溶液 1，1混合，即得。.5 m o l/L盐酸一 0.5 m o l/L抓化钠溶 液。A.1.5狡 甲基纤维素(C M一 纤维 素)干粉A.2 装 置A.2.1 梯度混合器:两瓶连通式，每瓶容量 2 0 0 ml-,A.2.2 柱层析系统:1.5 X4 0 c m玻璃层析柱，流量可达 2 ml./mi n 蠕动泵。A.2.3 冷冻干燥机。A.3A.3程序1 狡甲基纤维素的处理取 1 0 g般 甲基 纤维素(c m一 纤维 素)干粉 置于烧杯 中，加人 1 0 0 mL 0.5 m o l/L氢氧化钠-0.5 m o l/L 氯化钠溶液，混匀，静置 1 5 mi n后，用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于1 0 0 mL 1 mo l/L 盐酸溶液中，混匀，静置 1 0 m i n后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于 1 0 0 m l.0.5 m o l/L 盐酸一。.5 m o l/I氯化 钠溶液中，混匀，静置1 5 m in 后用布氏 漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于。.0 0 5 mo l/L p H6.0 磷酸缓冲液(A.1.2)中。A.3.2胆碱 酣酶的提取 取5 0 g 新鲜食用面粉置三角瓶中，加2 5 0 m 工 蒸馏水，振荡3 0 m i n,静置3 0 m i n 以上，取上清液经5 0 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n,收集上清液用冷冻干燥机浓缩至 2 0 mL左右，为胆碱醋酶粗提掖，保存于冰箱中待纯化。A.3.3 胆碱醋酶粗提液的纯化 将处 理 好 的 羚 甲基 纤 维 素是 浮 液加 人 层析 柱 中，加 1 5 0 mL 0.0 0 5 mo l/L p H6.0磷 酸缓 冲液G B/T 1 8 6 2 5-2 0 0 2(A.1.2)于梯度混合器的初始液瓶中，加 1 5 0 mL 0.1 mo l/L p H6.0 磷酸缓冲液(A.1.1)于梯度混合器的高浓 度液瓶中.连接往层析装置，以2 m L/m i n 流速做梯度洗脱，收集后1/2 流出液。A.14 冷冻干澡 将A.3.3 中的流出液用冷冻干燥机干燥成干粉，以。.2 g/瓶封装于安瓶瓶中 备用，于4 冰箱中可保存 1 年有效。