GBT 13648-1992 化学试剂 氨基酸测定通则.pdf

中华 人民 共 和 国 国 家 标 准 化学试荆氨基酸测，定通则G B 1 3 6 4 8 一 9 2 C h e m i c a l r e a g e n tGe n e r a l r u l e s f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f a mi n o a c i d s主题内容与适用范围本标准规定了氨基酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和灼烧残渣测定的通用方法。本标准适用于氨基酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用氨基酸的分析。引用标准G B 6 0 1 化学试剂 滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备G B 6 0 3 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备G B 6 0 8 化学试剂 氮测定通用方法G B 6 1 3 化学试剂比 旋光度测定通用方法G B 6 1 7 化学试剂熔点范围测定通用方法G B 6 6 8 2 实验室用水规格G B 9 0 0 8 液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法G B 9 7 4 1 化学试剂 灼烧残渣测定通用方法一般规定3.3本标准中所用的水，在没有注明其他要求时，应符合G B 6 6 8 2 中三级水的规格。本标准中 所用试剂的 纯度应在分析纯以上。本标准中凡层析测定时，氨基酸的R，值均应以在完全相同条件下的标准样品或工作标准样品的33.13.2R f 值为判断标准，且每次测定时都不得省去作为判断标准的标准样品或工作标准样品。.4 本标准中凡层析测定需做杂质限量检测时，应使用符合 6.1.2.2 条规定的工作标准样品。熔点测定按G B 6 1 7 之规定测定。氨基酸的熔点数值可参考附录B(参考件)。比旋光度的测定按G B 6”之规定测定。氨基酸的比旋光度数值可参考附录B(参考件)。D L型氨基酸的比旋光度应控制在。士。.5 0 范围之内。国家技术监督局1 9 9 2 一 0 9 一 0 1 批准1 9 9 3 一 0 7 一 0 1 实施G B 1 3 6 4 8 一9 26 层析试验 层析试验用于检测氨基酸的纯度及定性鉴别。所有氨基酸均应从下列方法中 选择一种方法进行测定。6.1 纸层析6.，.1 方法原理 纸层析法是以滤纸为惰性支持物的一种层析法。分离原理属分配层析的范畴，它利用不同 溶质在静止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相(即流动相)两相溶剂间的不断分配而达到分离的目 的。氨基酸经层析后，常用比移值(R,)来表示各组分在层析谱中的位置,R，值按式(1)计算:二“.，.，.。(1)式中:R,比移值;d,溶质迁移距离，c m;d m 流动相迁移距离,c m,在一定的条件下，同一氨基酸的R:值是一定的，但由于影响R,值的因素较多一 般都采用与标准物质对比，即根据试样与标准物质在层析谱中R，值来进行鉴别，并可根据显色后杂质斑点的多少和色量来确定试样纯度。6.1.2 试剂及材料6.，.2.1 标准样品 纸层析和薄层层析用标准样品，纯度不小于9 9.5%。6.，.2.2 工作标准样品 须经标准样品 验证，主体含量不应少于9 8.0%,6.1-2.3 层析用纸 层析用纸是指具有一定强度，质地均匀平整的纯棉浆制成的滤纸。纸的裁切方向 应使流动相能顺着纹理方向移动。定性用的层析滤纸灰分须小于。.1%0 一般可选用新华一号层析滤纸。6.1-2-4 显色剂(常用显色剂)称取4 g 布三酮(苯骄戊三酮)，溶于1 0 0 0 m L乙 醉(无水)中，置于 徐色瓶内 保存。苟 三酮除 对脯氨酸和轻脯氨酸产生黄色外，其他氮基酸均产生紫色。氮基酸的特殊显色剂可参照附录C(参考件)。6.1.2.5 展开剂 展开剂可参照附录A(参考件)之规定使用前制备。必要时可选用其他展开剂。6.1.2.6 展开室 可选用大小适宜的标本缸。6.1.3 操作步骤 取新华一 号层析滤纸，长3 0 c m，离底边2 c m处用铅笔划一直线，在直线两端2 c m处开始点样，点与点之间距离为2 c m，点样扩散的直径不超过0.5 c m。每点下面须用铅笔注明试样的名称和点样的量。同一张层析纸上可点数个试样，纸的宽度取决于试样的数目，并留有点标准样品或工作标准样品的位置。称 取。.0 0 5 g 氨 基 酸 试 样，精 确 至。，0 0 0 1 g,溶 于。，5 m L 水 或 盆 酸 溶 掖C c(H C I)一 0.5 m o l/L 中，稀释至5 m L。用微量进样器或微量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不少于5 p l，不多于1 0 p L，即相当于5 0 p g 和1 0 0 p g.氨基酸纸层析一般上行即可，可将已吹干的层析纸两边卷成圆筒状，用二根塑料丝上下固定。在一G B 1 3 6 4 8 一 9 2高为3 6 c m的标本缸内平放一培养皿，内盛高度为。.5 c m的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱和燕气平衡2 至4 h 后，试样端朝下放入培养皿中，盖紧玻璃盖。展开1 2 至1 6 h 后，流动相前沿即可上升2 7 至2 9 c m，此时将层析纸取出晾干或 5 0 干操，按 6.1.4 条之规定显色.6.1.4 显色 将已除去溶剂的层析纸喷以显色剂，冷风吹干后于5 0 -6 0 保温 1 5 2 0 m i n 即可显出有色斑点。6.1.5 结果的确定6.1-5.1 以1 0 0 p g 点样量，按规定展开并显色 后，只 显出 一个斑点，且与标 准样品或工作标准样品的R，值一致即为层析试验合格。6-1-5.2 以1 0 0 p g 点样量，按规定展开并显色后，除显一个主斑点外，其他氨基酸的斑点小于或等于按产品规格规定制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他氨基酸小于或等于标准。6.2 薄层层析6.2.1 方法原理 薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附 薄层层析法。6.2.2 试剂及材料6.2.2.1 标准样品 应符合6.1,2.1 条之规定。6.2.2.2 工作标准样品 应符合6.1.2.2 条之规定。6.2-2.3 硅胶G 本品系白色均匀细粉，粒度平均在1 0 -4 0 p m之间，含有约1 3%的半水硫酸钙。本品应符合下列分离要求:各取。0 4 0 g 二甲 基黄、苏丹g、靛酚蓝，溶于1 0 0 m L 苯中。取2 p L，点样于按6.2.3.1 条之规定制备的硅胶G板上，用苯展开1 0 c m，色谱图 应显示三个清晰的分离斑点，靛酚蓝斑点接近于起始点，二甲 基黄在色谱图的中央，苏丹，介于二者之间。6.2.2.4 纤维素粉(微晶形)本 品 为 白 色 均 匀 细 粉，平 均 粒 度 小 于3 q p m 本 品 应 符 合 下 列 分 离 要 求:各 取0.0 2 5 g 亮 黑、鸡 冠红、快黄、金莲橙.溶于1 0 0 m L甲 醇和水的混合溶液(1+1)中。取1 0 p L，点样于按6.2.3.1 条之规定制备的纤维素板上，以丙醇+乙酸乙醋十水的混合溶液(1 0 十1+4)为展开剂，上行1 0 c m，色谱图应显示四个清晰的分离斑点，即黑色斑点、红色斑点，两个黄色斑点，R，值依次增加。6.2-2.5 展开剂 应符合6.1.2.5 条之规定。必要时可选用其他展开剂。6.2-2.6 显色剂 参照 6.1.2.4 条之规定。6.2 3 操作步骤6.2-3.1 制板 制备薄层板所用的 玻璃板必须表面光滑、清洁，其大小可根据需要选择，小的可用载玻片，大的可裁成2 0 c m X 2 0 c m的玻璃片。取一定量的吸附剂(硅胶G可按2 5 3 0 g 加6 0 -6 5 m L水;纤维素粉可按8 g 加4 8 m L 水、2 m L乙醇)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为0-2-0.3 m c q 的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。2&R260G制板的时间从调糊状到铺板不应超过1.5 m i n aG B 1 3 6 4 8 一 9 2 氨基酸及氨基酸衍生物应使用在空气中干燥(不经过加热)的薄层板。市售的预制板经6.2.2.3 条或6.2.2.4 条试验符合分离要求的亦可使用。6.2.3.2 点样和展层 取薄层板一块，在距底边1.5 c m处开始点样，点与点之间的距离为1.5 c m，点样扩散的直径不超过0.2 c m。如需多次点样时，可用冷风将第一次点样吹干后，再点第二次。试样称取、溶解及点样用的器具应参照6.1.3 条之规定。薄层层析可选用大小适宜的标本缸。薄层板浸入展开剂的深度不超过。.5 c m，上行至流动相前沿离顶端 0.5 c m处(展开距离一般不超过 1 5 c m)取出，在5 0 干燥除去溶剂.6.2-3,3 显色 将已除去溶剂的薄层板喷以显色剂，冷风吹干后于5 0 -6 0 保温1 5 -2 0 m i n 即可显出 有色斑点。6.2.4 结果的确定 应符合6.1.5.1 条及 6.1.5.2 条之规定。7 含l测定 氨基酸的含量通常可按下述两种方法之一进行测定。7.1 氮测定法 按G B 6 0 8 之 规定测定。本方法适用于全部氨基酸的含量测定。7.2 非水滴定法7-2-1 适用范围 本方法适用于能溶于乙酸(冰醋酸)的具有碱性的氨基酸样品的含量测定，不适用于氨基酸盐酸盐样品的含量测定。7.2.2 试剂7.2-2.1 高氯酸标准滴定溶液C c(H C 1 0,)=0.1 m o l/L)按G B 6 0 1 之规 定制备。7.2.2.2 结晶紫指示液的制备 称取。.2 0 g 结晶紫，溶于乙酸中，用乙酸(冰醋酸)稀释至1 0 0 m L,了.2.3 氨基酸含量N il 宁 按 产 品 标 准 的 规 定，称 取 一 定 量 的 试 样，精 确 至0.0 0 0 1 g,解，加2 滴 结晶 紫 指 示 液(7.2.2.3)，用 高 氯 酸标 准 滴 定 溶 液(7白试验。置于干燥的锥形瓶中，加5 0 m L乙酸溶2.2.1)滴定至溶液呈蓝绿色。同时做空含量按式(2)计算 (V,一 V,)c 材w=一 一 一n 厂 一 一 X 1 0 0“二 二 二 二 “(2)式中:W-氨基酸的含量，%;V,-样品消耗高氯酸标准滴定溶液的体积,m L;V,空白 试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，m L,c-高氯酸标准滴定溶液的浓度，m o l/L sM与1.0 0 m L高氯酸标准滴定溶液 c(H C I O,)质量;=1.0 0 0 m o l/L)相当的，以 克表示的氨基酸的m 试样的质量，R。8 灼烧残注按G B 9 7 4 1 之规定测定。G B 1 3 6 4 8 一9 2 附录A常用氮基酸展开剂的组成和配比表 (参考件)展开剂配比 体积比)说明1.正了 醉+乙酸+乙醉(无水)+水4+1+1+2纸层析常用展开剂2.仲丁醉十甲酸(8 4%)+水1 5 斗3+23.正丁醉十甲基乙基丁酮+氨水+水5+3+3+1纸层析分离苏氨酸和别苏氨酸的展开剂4仲丁醉+氨水(3%)1 5 十 6纸层析常用展开剂5.正丁醉十丙酮+二环己 胺+水1 0 十1 0+2+5纸层析分离碱性氨基酸常用展开剂6.正丁醉+丙酮+二乙胺+水1 0+1 0+2+5薄层层析常用展开剂7.异丙醉+甲 酸(8 4%)+水4 0 十2+1 08.苯+毗咤+乙酸8 十2 0+29.A+B3+7薄层层析分离氨基酸衍生物常用展开剂A;毗吮+乙酸十水1 十1 十1.5B乙酸乙醋+异丙醉1 0+41 0.正丁醉+乙酸十水4 十 1+1附录B常用氮荃酸的比旋光度和熔点 (参考件)表 B 1中文名称英文名称(缩写)知 对 分 子 质 纠熔点，溶解度幻比旋光度，司黔2 5D L-丙氨酸DL-a l a n i n e(Al a)8 9.0 92 9 5 d1 6.6L-丙氨酸L-a l a n i n e(A l a)8 9.0 92 9 7 d1 6.6 5