GBT 16347-1996 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验.pdf

中华人民共和 国 国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验G B/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 6 Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o fl a ct i c a c i d b a c t e r i a i n y o g h u r t b e v e r a g e1 主题内容与适用 范围 本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以 大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。2 引用标准 G B 4 7 8 9.2 8，食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂3 术语 乳酸菌:一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴 性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。乳酸菌菌落总数:检样在一定条件下培养后，所得1 m l,检样中 所含乳酸菌菌落的总数。4 设备和材料:温箱:3 6 士1 0C。冰箱:0-4 C。恒温水浴:4 6 士1 0C,电炉:可调式。吸管:容量为1,1 0 和2 5 m L,广口 瓶或三角瓶:容量为5 0 0 m L.平皿:直径为9 C m.试管:1 8 X 1 8 0 m m,显微镜。月.门艺勺d月勺尸汽叹，了 .月月叼月q月q月咔月q月q5 培养荃和试荆5.1 改良T J A培养基(改良 番茄汁琼脂培养基)。5.2 改良M C培养基(M o d i f ie d C h a l m e r s 培养基)。5.3 0.1%美兰牛乳培养基。5.4 6.5%抓化钠肉汤。5.5 p l-I 9.6 葡萄搪肉汤。5.6 4 0%胆汁肉 汤。57 淀粉水解培养基。中华人民共和国卫生部1 9 9 6 一 0 6 一 1 9 批准1 9 9 6 一 0 9 一 0 1 实施G B/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 65.8 精氨酸水解培养基。5.9 乳酸杆菌糖发醉管。5.1 0 七叶昔培养基。5.1 1 革兰氏染色液:按G B 4 7 8 9.2 8 规定执行。5.1 2 3%过氧化氢溶液:按G B 4 7 8 9.2 8 规定执行。5.1 3 蛋白 陈水、靛基质试剂:按G B 4 7 8 9.2 8 规定执行。5.1 4 明胶培养基:按G B 4 7 8 9.2 8 规定执行。5.1 5 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂:按G B 4 7 8 9.2 8 规定执行。5 门6 生理盐水:定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。6 乳酸曲曲落总擞的测定6.1 检验程序 乳酸菌菌落总数检验程序如下:检作成几个适当倍数的稀释液选择2-3 个适当稀释度，各以1 m L之量加入灭菌平皿内每皿 内加人 适 量 改 良T J A或 改 良MC培 养 基3 6 士 I C 菌落十7 2 士3h计数报告6.2 操作步孩6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样2 5 m L(或2 5 g)放人含有2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成 1:1 0 的均匀稀释液。6.2.2 用1 m L 灭菌吸 管吸取1:1 0 稀释液1 m L,沿管壁徐徐注入含有9 m L灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。6.2.3 另取1 m L 灭菌吸管，按上述操作顺序，作1 0 倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1 支1 m L灭菌吸管。6.2.4 选择2-3 个以上适宜稀释度，分别在作1 0 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 m L 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至5 0 的乳酸菌计数培养基(改良T J A或改良M C)注入平皿约1 5 m L，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1 m L稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自 培养物加入培养皿开始至接种结束须在2 0 m i n内 3 7 5G s/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 6完成。6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置3 6 士1 温箱内 培养7 2 士3 h 取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1),选取菌落数在3 0-3 0 0 之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5 个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳 性，过氧化氢酶阴 性，无芽胞的 球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样1 0-的稀释液在改良T J A琼脂平板上，生成的可疑菌落为3 5 个，取5 个鉴定，证实为乳酸菌的是4 个，则1 m L检祥中 乳酸菌数为:3 5 X 音 X 1 0 =2.8 又1 0 56.3 乳酸菌在改良T J A和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1,表 1 乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良T J A改良MC杆菌平皿底为黄色，菌落中等大小，徽白色，湿润。边缘不整齐，直径3 士1 m m，如棉絮团状菌落平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径 2 士1 m m，可有淡淡的晕球菌 一平皿底为黄色，菌落光滑，湿润。徽白 色，边缘整齐 平皿底为粉红色，菌落较小，圈形，红色，边 缘整齐，可有淡淡的晕 注:干酪乳杆菌在改良T J A培养墓上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。7 乳酸菌的鉴定 对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。7.1 菌种制备:自 平板上挑取菌落，接种于改良T J A或改良M C 琼脂斜面，于3 6 士1 0C,2 4-4 8 h 培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。72 乳酸杆菌鉴定试验:极少见还原硝酸盐，不液化明 胶，不产生靛基质和硫化氢。7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3,表2 常见乳杆菌属内 种的碳水化合物反应七叶昔纤维二糖麦芽糖甘聪醉水杨昔山梨醉蔗糖干酪乳杆菌干酪亚种保加利亚乳杆菌嗜酸乳杆菌乳酸乳杆菌+#十十d+d+G B/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 6表 3 产乳酸的链球菌的鉴别表生长试验加热6 0 C 3 0 mi n水解淀粉水解精氨酸1 0 C4 5 0.1%美兰牛乳6.5%抓化钠4 0%胆汁p H9.6啥热链球菌乳链球菌乳脂链球菌十+十+d+十dd+注:d 有些菌株阳 性.有些菌株阴性.37 7G B/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 6 附录A数种专用培养荃及试剂 (补充件)A 1 改良T J A培并基(改血番茄汁琼脂培并荃)A l.1 成分 番茄汁5 0 m L 醉母抽提液5 g 肉 膏l o g 乳糖2 0 9 葡萄糖2 9 k.,H P O,2 g 吐温 8 0 1 g 乙 酸钠5 9 琼脂1 5 9 水加至1 0 0 0 m L p H 6.8 士0.2A 1.2 制法 番茄汁的制作:将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎)，放入三角烧瓶，置4 冰箱8 1 2 h，取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入。冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。制法:将所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正p H 6.8 士0.2 分装烧瓶，高压灭菌 1 2 1 0C 1 52 0 m i n,临用时加热熔化琼脂，冷至5 0 时使用。A 2 改良MC培养墓A 2.1 成分 大豆蛋白 脏5 9 牛肉浸膏5 9 酵母浸青5 9 葡萄糖2 0 g 乳糖2 0 9 碳酸钙1 0 g 琼脂1 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m L 1%中性红溶液5 m L 硫酸多粘菌素B(酌情而加)1 0 万国际单位A 2.2 制法 将前面7 种成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正p H 6，加人中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌 1 2 1 C1 5 2 0 m i n。临用时加热熔化琼脂，冷至5 0 C,酌情加或不加硫酸多粘菌素B(检样有胖听或开罐后有异味等怀疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B,混匀后使用)。A 3 0.1%美兰牛乳培养签 新鲜脱脂牛乳9 0 m1G B/T 1 6 3 4 7 一 1 9 9 6 1 写美兰水溶液1 0 m LA 4 6.5 0 o 抓化钠肉 汤 肉浸液(p H 7.6)1 0 0 m L 抓化钠6 9A 5 p H 9.6 菊萄 铂肉 汤 普通肉汤校正p H 9.6 加人。.2 0 0 葡萄糖。A 6 4 0 0 o 胆汁肉汤 p H 7.6 肉浸液6 0 m L 葡萄 糖。.1 2 g 牛胆汁4 0 m LA 7 淀粉水解培并荃 p H 7.6肉浸液琼脂9 0 m L 羊血清5 m L 3 0 0 淀粉溶液1 0 m LA T 1 将肉浸液琼脂溶化。A 7.2 待冷至5 0 左右以无菌操作加入淀粉溶液及无菌羊血清混合后，倾注平板。A$精扭酸水解培养签蛋白脏抓化钠磷酸氢二钾L-精氨酸1.6 0 0 澳甲酚紫酒精溶液琼脂蒸馏水p H7.20.1 g0.5 g0.6 g1g1.4 mL0.3 g1 0 0 mLA 9 乳酸杆曲抽发醉管A 9.1 基础成分 牛肉 膏5 9 t蛋白陈5 9 酵母浸膏5 9 吐温 8 0 0.5 mL 琼脂1.5 9 1.6 0 0 澳甲 酚紫酒精溶液1.4 m L 蒸馏水1 0 0 0 mLA 9.2 按。5%加入所需糖类，并分装小试管。A 1 0 七叶普培养荃蛋白陈5只G B/T 1 6 3 4 7 一1 9 9 6礴酸氢二钾七叶昔拘椽酸铁1.6 0 o 澳甲酚紫酒精溶液蒸馏水1g3g0.5 gl.4 mL1 0 0 ml附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由 南京市卫生防疫站、广东省食品卫生监督检验所、上海市食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人陈晓蔚、刘敏、杨明、宋曼丹、瞿明娟、周蓓君。本标准由 卫生部委托技术归口 单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。