GBT 14926.50-2001 实验动物 酶联免疫吸附试验.pdf

I C S月 4 46 5.0 2 0.3 0暑昌中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6.5 0 一1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(3 L a b o r a t o r y a n i ma l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n me t h o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9发 布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 周GB/T 1 4 9 2 6.5 01 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1目录G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验 1G B/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1 实验动物免疫酶试验.5G B/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1 实验动物免疫荧光试验.9G B/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1 实验动物 血凝试验 二 二”二 二 二 .1 2G B/T 1 4 9 2 6.5 4-2 0 0 1 实验动物血凝抑制试验.1 5G B/T 1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1 实验动物免疫酶组织化学法 .1 9GB/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1前言 本标准修订了G B/T 1 4 9 2 6.1 8-1 9 9 4(实验动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法 中的酶联免疫吸附试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准实验动物酶联免疫吸附试验G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1L a b o r a t o r y a n i ma l-En z y me-l i nk e d i mmu n o s o r b e n ta s s a y(ELI S A)范围本标准规定了酶联免疫吸附试验(E L I S A)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。原理 包被于固 相载体表面的已 知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物。此 抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。主要试 剂和器材试 剂1 抗 原1.1特异性抗原3313131 将病毒接种其敏感细胞培养增殖(表 1)，当细胞病变达+一+时收获，冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成E L I S A抗原。3.1 门.2 正常抗原 未接种病毒的相应细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。3.1.2 酶结合物 E L I S A法常用以下两类酶结合物。3.1.2 门 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴I g G抗体。用于检测相应动物血清抗体。3.1.2.2 辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(S P A)。用于检测小鼠、豚鼠、兔、犬和猴血清抗体。3.1.3 对照血清3.1.3.1 阳性血清 用病毒抗原免疫清洁或 S P F小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级兔、犬、猴所获得的抗血清;或 自然感染恢复后的犬、猴血清。3.1.3.2 阴性血清 清洁或S P F小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或确认无相应病毒感染的兔、犬、猴血清。3.1.4 包被液(0.0 5 mo l/L p H9.6)碳酸钠1.5 9 g 碳酸氢钠2.9 3 g 蒸馏水加至 1 0 0 0 M I.3.1.5 P B S(0.0 l mo l/I.p H7.4)中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局 2 0 0 1 一 0 8-2 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1实施 zGB/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 氯化钠89 氯化钾0.2 g 磷酸二氢钾0.2 g 磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H,O)2.8 3 g 蒸馏水加至 1 0 0 0 mL3.，.6 洗涤液 P B S(0.0 1 mo l/L p H7.4)1 0 0 0 mL T we e n-2 0 0.5 m L3.1.7 稀释液含 1 0%小牛血清的洗涤液。3.1.8 磷酸盐一 柠檬酸缓冲液(p H5.0)柠檬酸3.2 6 g 磷酸氢二钠(N a 2 HP O,1 2 H2 0)1 2.9 g 蒸馏水7 0 0 mL3.1.9 底物溶液 磷酸盐一 柠檬酸缓冲液(p H5.0)1 0 mL 邻苯二胺(O P D)4 mg 3 0%过氧化氢2 P I3.1-1 0 终止液(2 mo l/L硫酸)硫酸5 8 m L 蒸馏水4 4 2 mI3.2 器材3.2.1 酶标仪。12.2 聚苯乙烯板:4 0孔、5 5 孔或 9 6孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，在紫外线下 2 0 c m处照射1 he2.3 微量加样器:容量5-v 5 0 p L,5 0-v 2 0 0 k L,2.4 3 7 C 培养箱。操作步骤3象月4.1 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原和正常抗原分别用 包被液稀释。每孔1 0 0 y L，置3 7 C 1 h后再 4 过 夜。4.2 用洗涤液洗 5 次，每次 3 mi n，叩干。4.3加样 待检血清和阴性、阳性对照血清分别用稀释液做 1，4 0稀释，分别加人两孔(特异性抗原孔和正常抗原孔)，每孔1 0 0 y L,3 7 C 1 h，洗涤同上。4.4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔加人1 0 0 p L,3 T C 1 h，洗涤同 上。4.5 加底物溶液 每孔加人新配制的 底物溶液1 0 0 I L，置3 T C,避光显色1 0.1 5 m i n,4.6 终止反应 每孔加人终止液5 0 p L,4.7 测 A值 在酶标仪上，于4 9 0 n m处读出各孔A值。Gs/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 15 结果判 定 在阴性和阳性对照血清成立的条件下，进行结果判定。5.1 同时符合下列 3 个条件者，判为阳性。51.，待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别;5.1.2 待检血清与特异性抗原反应的A值)0.2;5.1.3 待检血清与特异性抗原反应的A值/阴性对照血清与特异性抗原反应的A值)2.I,5.2 均不符合上述 3 个条件者，判为阴性。5.3 仅有 I-2 条符合者，判为可疑。需选用同一种方法或另一种方法重试。轰 1 E L I S A拭原的制备