GB 4789.13-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB 4789.132012食品安全国家标准食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部发布2012-05-17 发布2012-07-17 实施GB 4789.132012I前言本标准代替 GB/T 4789.132003食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验。本标准与 GB/T 4789.132003 相比，主要变化如下：修改了标准的中文名称；修改了样品制备过程；修改了培养基与试剂；修改了操作步骤；修改了菌数计算部分；增加了附录 A。GB 4789.1320121食品安全国家标准食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验1范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36 1；b）冰箱：2 5；c）恒温水浴箱：501，460.5；d）天平：感量 0.1 g；e）均质器；f）显微镜：10100；g）无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm180mm；i）无菌培养皿：直径 90 mm；j）pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；k）厌氧培养装置。3培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录 A 中 A.1。3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录 A 中 A.2。3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录 A 中 A.3。3.4乳糖-明胶培养基：见附录 A 中 A.4。3.5含铁牛乳培养基：见附录 A 中 A.5。3.60.1%蛋白胨水：见附录 A 中 A.6。3.7革兰氏染色液：见附录 A 中 A.7。3.8硝酸盐还原试剂：见附录 A 中 A.8。3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录 A 中 A.9。4检验程序GB 4789.1320122产气荚膜梭菌检验程序见图 1。图 1 产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在 2 5 保存；如 8 h 内不能进行检验，应以无菌操作称取 25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2以无菌操作称取 25 g（mL）样品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水（如为 5.1.1 中冷冻保存样品，室温解冻后，加入 200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1 min2 min；或置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min10 000 r/min 均质 1min2 min，作为 1:10 稀释液。5.1.3以上述 1:10 稀释液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制备 10-210-6的系列稀释液。检样25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水均质、稀释10-110-6稀释液各 1mL+TSC 琼脂混合厌氧培养，361、20h24h，黑色菌落计数任选黑色菌落 5 个，分别接种 FTG 培养基确证试验镜检形态乳糖-明胶动力-硝酸盐牛奶发酵报告GB 4789.13201235.2培养5.2.1吸取各稀释液 1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至 50 的 TSC琼脂（可放置于 50 1 恒温水浴箱中保温）15 mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。5.2.2上述琼脂平板凝固后，再加 10 mL 冷却至 50 的 TSC 琼脂（可放置于 50 1 恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。5.2.3待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36 1 培养 20 h24 h。5.2.4典型的产气荚膜梭菌在 TSC 琼脂平板上为黑色菌落。5.3确证试验5.3.1从单个平板上任选 5 个（小于 5 个全选）黑色菌落，分别接种到 FTG 培养基，36 1 培养18 h24 h。5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种 TSC 琼脂平板进行分纯，36 1 厌氧培养 20 h24 h，挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG 培养基，36 1 培养 18 h24 h，用于后续的确证试验。5.3.3取生长旺盛的 FTG 培养液 1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在 46 0.5 水浴中培养 2 h 后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。5.3.4用接种环（针）取 FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于 36 1 培养 24 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5 mL 试剂甲和 0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置 10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5用接种环（针）取 FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于 36 1 培养 24 h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5 左右放置 1 h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于 36 1 再培养 24 h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。6结果与报告6.1典型菌落计数选取典型菌落数在 20 CFU200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20CFU200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于 20 CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在 20 CFU200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；e）2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在 20CFU200CFU 之间，分别计数 2 个稀释度平板上的典型菌落。6.2结果计算6.1 计数结果按公式（1）计算：GB 4789.1320124(1)式中：T样品中产气荚膜梭菌的菌落数；A单个平板上典型菌落数；B单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；C单个平板上用于确证试验的菌落数；n1第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；0.1稀释系数；d稀释因子（第一稀释度）。6.3报告根据 TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照 6.2 中公式计算，报告每 g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以 CFU/g（mL）表示；如 T 值为 0，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。dnnCBAT)1.0()(21+=GB 4789.1320125附录 A培养基和试剂A.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂A.1.1 基础成分胰胨15.0 g大豆胨5.0 g酵母粉5.0 g焦亚硫酸钠1.0 g柠檬酸铁铵1.0 g琼脂15.0 g蒸馏水900.0 mLpH 7.60.2A.1.2 D-环丝氨酸溶液溶解 1 gD-环丝氨酸于 200 mL 蒸馏水，膜过滤除菌后，于 4 冷藏保存备用。A.1.3 制法将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节 pH，分装到 500 mL 烧瓶中，每瓶 250 mL，121 高压灭菌15 min，于 50 1 保温备用。临用前每 250 mL 基础溶液中加入 20 mL D-环丝氨酸溶液，混匀，倾注平皿。A.2 液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）A.2.1 成分胰蛋白胨15.0 gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0 g葡萄糖5.0 g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g蒸馏水1 000.0 mLpH 7.10.2A.2.2 制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节 pH，分装试管，每管 10 mL，121 高压灭菌 15 min。临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min，迅速冷却至接种温度。A.3 缓冲动力-硝酸盐培养基A.3.1 成分蛋白胨5.0 g牛肉粉3.0 g硝酸钾5.0 g磷酸氢二钠2.5gGB 4789.1320126半乳糖5.0 g甘油5.0 mL琼脂3.0 g蒸馏水1 000.0 mLpH 7.30.2A.3.2 制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，调节 pH，分装试管，每管 10 mL，121 高压灭菌 15 min。如果当天不用，置 4 左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min，迅速冷却至接种温度。A.4 乳糖-明胶培养基A.4.1 成分蛋白胨15.0 g酵母粉10.0 g乳糖10.0 g酚红0.05g明胶120.0 g蒸馏水1 000.0 mLpH 7.50.2A.4.2制法加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于 1000 mL 蒸馏水中，调节 pH，加入乳糖和酚红。分装试管，每管 10 mL，121 高压灭菌 10 min。如果当天不用，置 4 左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min，迅速冷却至接种温度。A.5 含铁牛乳培养基A.5.1 成分新鲜全脂牛奶1 000.0 mL硫酸亚铁（FeSO47H2O）1.0 g蒸馏水50.0 mLA.5.2 制法将硫酸亚铁溶于蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入 1000 mL 牛奶中，混匀。分装大试管，每管 10 mL，118 高压灭菌 12 min。本培养基必须新鲜配制。A.6 0.1%蛋白胨水A.6.1 成分蛋白胨1.0 g蒸馏水1 000.0 mLpH 7.00.2A.6.2制法加热溶解，调节 pH，121 高压灭菌 15 min。A.7 革兰氏染色液A.7.1 结晶紫染色液A.7.1.1 成分结晶紫1.0gGB 4789.132012795%乙醇20.0 mL1%草酸铵水溶液80.0 mLA.7.1.2 制法将结晶紫完全溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.7.2 革兰氏碘液A.7.2.1 成分碘1.0 g碘化钾2.0 g蒸馏水300.0 mLA.7.2.2 制法将碘与碘化钾先混合，加入蒸馏水少许振摇，待完全溶解后，再加入蒸馏水至 300 mL。A.7.3 沙黄复染液A.7.3.1 成分沙黄0.25 g95%乙醇10.0 mL蒸馏水90.0 mLA.7.3.2 制法将沙黄溶解于 95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.7.4 染色方法涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色 1 min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。滴加 95%乙醇脱色约 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染 1 min，水洗、待干、镜检。A.8 硝酸盐还原试剂A.8.1 甲液（对氨基苯磺酸溶液）在 1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解 8 g 对氨基苯磺酸。A.8.2 乙液（-萘酚乙酸溶液）在 1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解 5 g-萘酚。A.9 缓冲甘油-氯化钠溶液A.9.1 成分甘油100.0 mL氯化钠4.2 g磷酸氢二钾（无水）12.4 g磷酸二氢钾（无水）4.0 g蒸馏水900.0 mLpH7.20.1A.9.2 制法将以上成分加热至完全溶解，调节pH，121 高压灭菌15 min。配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油200 mL和蒸馏水80