GBT 14926.53-2001 实验动物 血凝试验.pdf

I C S月 4 46 5.0 2 0.3 0暑昌中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6.5 0 一1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(3 L a b o r a t o r y a n i ma l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n me t h o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9发 布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 周GB/T 1 4 9 2 6.5 01 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1目录G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验 1G B/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1 实验动物免疫酶试验.5G B/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1 实验动物免疫荧光试验.9G B/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1 实验动物 血凝试验 二 二”二 二 二 .1 2G B/T 1 4 9 2 6.5 4-2 0 0 1 实验动物血凝抑制试验.1 5G B/T 1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1 实验动物免疫酶组织化学法 .1 9GB/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1前言 本标准修订了G B/T 1 4 9 2 6.2 4-1 9 9 4(实验动物 小鼠 肺炎病毒检测方法 中的血凝试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准实验动物血凝试验Gs/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1L a b o r a t o r y a n i ma l-Ha e mo g l u t i n a t i o n t e s t(HA)范 围本标准规定了血凝试验(H A)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗原的检测。原理某些病毒在一定的条件下，能够选择性地凝集某些动物红细胞，产生可见的凝集反应主要试 剂与器 材试 剂，血凝素血凝素抗原除部分病毒(如痘类病毒)能与感染性颗粒分开外，大部分是与病毒的感染性颗粒相关33131联，凡培养于鸡胚或组织培养中的病毒及其抗原物质，经离心除去沉淀，均可用作血凝试验的抗原(见表1、表 2),表 1 血凝素制备方法病 毒细 胞收 毒(d)病 变(+)抗 原 处 理滴度(HA)备注K RV H-1C P VI CH V R V RE REFK 8 1M DCKBHK 2 17-1 27-1 23-53-44-52-32-33-43-42-3冻融 2-3 次，2 0 0 0 r/min离心 1 0 -2 0 min，取上清离心 1 0-2 0 min，取上清培养物冻融后离心，取上清，经 6 0 水浴作用 1 0-2 0 m i n冻融 2 一3次，2 0 0 0 r/m i n离心 2 0 mm取上清6 4-1 2 8 1 2 8 6 4 0 1 2 8 0 32 0基础液中含。.2%0.4%牛血清白蛋白表 2 血凝素制备方法病 毒动 物(日龄)接种途径 剂 量抗 原 取 材d ial(d)抗 原 处 理滴度(HA)TM EVSe nd a iRH DV 小 鼠(1 4 -2 1)鸡 胚(9)兔 ic 0.0 2 mL尿囊 0.2 mL s c 2 m L 脑尿囊液 肝5-7 32-4研磨成 1 0%悬液，冻化 2-3次1 0 0 0 r/min 离心 1 0 mm，上清对倍加。.5%胰酶,4 C 可短期保存2 0 0 0 r p m离心1 0 m m,取上清液研磨成1 0 绒悬液 3 0 0 0 r(min离心1 0 min取上清1 2 8-5 1 2 6 4 0 8 1 9 0中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 1-0 8-2 9批准2 0 0 2一 0 5一 0 1实施 1 3GB/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 13.1.2 红细胞悬液 根据不同病毒血凝所需敏感红细胞制备悬液，一般将血液保存于阿氏溶液内，使用前用 p H 7.4P B S洗三次，再悬于 p H7.4 P B S中。3.1.3 P B S(0.0 1 mo l/L,p H7.4)抓化钠89 氛化钾0.2 g 磷酸二氢钾0.2 g 磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H2 0)2.8 3 g 蒸馏水加至 1 0 0 0 m L3.1.4 阿氏溶液 葡萄糖2.0 5 g 拘棣酸钠0.8 g 拘椽酸。0 5 5 g 抓化钠0.4 2 g 燕馏水1 0 0 m L3.23.23.23.23.241 1 5 C灭菌3 0 m i n，保存于 4 C,器材1 恒温培养箱。2 微量震荡器。3 微量血凝反应板(u型或 v型)。4 微量加样器(容量 5-5 0 p L)或微量稀释棒。操作步骤将血凝素用P B S做连续倍比稀释，每稀释度留2 5 w L于微量血凝板孔内。每孔内再加2 5 p L P B S与 5 0 IA L红细胞悬液，摇匀。同时设立红细胞对照。置所需温度作用 3 0 6 0 m i n.4.14243结果判定将出现血凝“+”的最高稀释度定为该血凝素的效价。各孔血凝结果以+、+、+、+、一表示。+十+:红细胞一片凝集，均匀铺于孔底。+:红细胞凝集基本同上，孔底有大圈。+:红细胞于孔底形成一个中等大的圈，四周有小凝块。+:红细胞于孔底形成一个小圈，四周有少许凝块。一:红细胞完全不凝集，沉于孔底。