GBT 14926.51-2001 实验动物 免疫酶试验.pdf

I C S月 4 46 5.0 2 0.3 0暑昌中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6.5 0 一1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(3 L a b o r a t o r y a n i ma l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n me t h o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9发 布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 周GB/T 1 4 9 2 6.5 01 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1目录G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验 1G B/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1 实验动物免疫酶试验.5G B/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1 实验动物免疫荧光试验.9G B/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1 实验动物 血凝试验 二 二”二 二 二 .1 2G B/T 1 4 9 2 6.5 4-2 0 0 1 实验动物血凝抑制试验.1 5G B/T 1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1 实验动物免疫酶组织化学法 .1 9GB/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1前言 本标准修订了 G B/T 1 4 9 2 6.1 8-1 9 9 4 实验动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法 中的免疫酶试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准实验动物免疫酶试验GB/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1L a b o r a t o r y a n i ma l-I mmu n o e n z y me a s s a y(I E A)范围本标准规定了免疫酶试验(I E A)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。原理 含有病毒抗原的细胞固定于玻片上，遇相应抗体形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合，遇酶底物产生颜色反应。在普通显微镜下，根据颜色的反应判定结 果。主要试剂与器材试剂，抗原片1.1 抗原 片的制备3313131 将病毒接种敏感细胞(表 1)，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后，用胰酶消化分散细胞，P B S 洗涤三次，最 后用适量P B S 悬浮细胞。将细胞悬液 滴于 玻片孔内 同时消化不感染病毒的同批同种细胞，滴加同一玻片另一孔内，作为正常细胞对照。孔内滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜。室温干燥后，冷丙酮(4 0C)固定 1 0 mi n。用蒸馏水漂洗后充分干燥，置于一2 0 备用。3.1.1.2 抗原片的鉴定 每批抗原片在使用前，用相应的阳性血清和阴性血清进行鉴定。鉴定方法可用I E A或免疫荧光试验。在阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应无色;阳性血清与正常细胞反应无色，而与病毒感染细胞呈棕褐色，且阳性细胞数达 3 0%5 0%时，此批抗原片可以使用3.1.2 酶结合物 抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬或猴 工 g G抗体辣根过氧化物酶结合物用于检查相应动物的血清抗体。葡萄球菌蛋白A(S P A)辣根过氧化物酶结合物可代替抗小鼠、豚鼠、兔、犬和猴 坛G抗体辣根过氧化物酶结合物使用。3.1.3 阳性血清 用病毒抗原免疫清洁或 S P F级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级免、犬、猴所获得的抗血清;或自然感染恢复后的犬、猴血清。3.1.4 阴性血清 清洁或S P F级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或确认无相应病毒感染的兔、犬、猴血清。3.1.5 P B S(0.0 1 mo l/L,p H7.4)氯化 钠89 氯化钾0.2 g中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 1-0 8-2 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1 实施 sGB/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠(N a z H P 0,1 2 H 2 0)蒸馏水3.1.6 底物溶液(现用现配)3,3 一 二胺基联苯胺盐酸盐(D AB)P B S(0.0 1 m o l/L,p H7.4)丙酮 3 3%过氧化氢3.2器材3.2.1 普通显微镜。3.2.2 印有 1 0 -4 0 个小孔的玻片。3.2.3 微量加样器，容量 5 一5 0 p L,3.2.4恒温水浴箱。0.2 g2.8 3g加至 1 0 0 0 mL4 0 mg1 0 0 m l-5 M L0.1 m l-4 操作步骤4.1 取出抗原片，室温干燥后，滴加适当稀释的待检血清和阴性、阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，3 7 C 3 0 mi n,4.2 P B S洗三次，每次5 min，室温干燥。4.3 滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，3 7 C 3 0 mi n e4.4 P B S洗 3 次，每次5 min.4.5 将玻片放人底物溶液中，在室温下显色 5 1 0 m i n,P B S漂洗 2 次，再用蒸馏水漂洗 1 次。4.6 吹干后，在光镜下判定结果。5结果判 定 在阴性、阳性对照血清成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应无色;阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞呈棕褐色，即可判定结果。5.1 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，判为阴性。5.2 待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕褐色，判为阳性。根据颜色深浅可判为十一+。表 1 I E A细胞抗原片的制备G B/r 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1表 1(完)病毒敏感细胞收获时间，d病 变涂 片 制 备 H-1SA l lCDVBVi r us SP V REM A-1 0 4 Ve r o Ve r oBHK 2 17-1 22-35-71-21-2+十+分散细胞涂片，固 定鉴定，保存注:MK小鼠肾细胞;ME 一 小鼠胚细胞;RK 一 大鼠肾细胞;R E 一 大鼠胚细胞。