GBT 13266-1991 水质 物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法.pdf

中华人 民共 和国国家标 准水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法G B/T 1 3 2 6 6 一 9 1Wa t e r q u a l i t y-D e t e r mi n a t i o n o f t h e a c u t e t o x i c i t yo f s u b s t a n c e t o D a p h n i a(D a p h n i a m a g n a s t r a u s)本标准 参照 采用国 际 标准I S O 6 3 4 1-1 9 8 2 水质 大璧蚤 运动 抑制的测定。本标准用大型蚤 D a p h n i a m a g n a s t r a u s(C l a d o c e r a C r u s t a c e a)为试验生物。测定物质或废水的半数抑制浓度，半数致死浓度(2 4 h-E C 5 0,2 4 h-L C 5。或4 8 h-E C 5 0,4 8 h-L C 5 0)，用于判断物质或废水的毒性程度。1 适用范围本标准适用于以下范围:a.在试验条件下可溶的化学物质(包括工业原料和产品、食品添加剂、农药、医药等)。b，工业废水。c 生活污水。d地表水、地下水。2 原理2.1 2 4 h-E C 5 0,4 8 h-E C 5 0 指在2 4 或4 8 h 内 百分之五十的受试蚤运动受抑制时被测物的浓度。2.2 运动受抑制(I m m o b i l i z a t i o n)反复 转动试 验容器,1 5 s 之内 失 去活 动能力的 大型蚤，被 认为运动受 抑制。即 使其 触角 仍能活动，也应算做不活动的个体。2.3 2 4卜 L C 5 0,4 0 h-L C 5 0 指在2 4 或4 8 h内百分之五十的受试蚤死亡时被测物的浓度，以受试蚤心脏停止跳动为其死亡标志。3 试验材料3，试验生物为大型蚤(D a p h n i a m a g n a s t r a u s)(甲 壳纲，枝角 亚目)。保持良 好的培养条件，使大型蚤的繁殖被约束在孤雌生殖的状态下(见附录A),选用实验室条件下培养3 代以上的、出生6 -2 4 h 的幼蚤为试验蚤。试验蚤应是同一母体的后代。3.2 试验用水:3.2.1 配制人工稀释水为试验用水。新配制的标准稀释水p H为7.8 士。2,硬度2 5 0 士2 5 m g/L(以C a C O。计)C a/M g比 例接近4:1,溶解氧浓度在空气饱和值的8 0%以上，并不含有任何对大型蚤有毒的物质。人工稀释水用电导率1 0 p 5/c m(1 m S/m)以下的蒸馏水或去离子水(以下简称水)按下述方法配蘸而而瘫 1 9 9 1-Q 9 下 4 I 蔺-1 9 9 2 一 Q$一 Q 1 实施G B/T 1 3 2 6 6 一 9 1制。氯化钙溶液 将1 1.7 6 g 氯化钙(C a C t,2 H 2 0)溶于水中稀释至1 L,b.硫酸镁溶液 将4.9 3 g 硫酸镁(Mg S O,7 H 2 0)溶于水中稀释至 1 1。碳酸氢钠溶液 将2.5 9 g 碳酸氢钠(N a H C 0 3)溶于水中稀释至1 L,d.氯化钾溶液 将0.2 5 g 氯化钾(K C l)溶于水中 稀释至1 L.各取以上四种溶液2 5 m L混合，稀释至1 L.必要时可用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节p H值，使其稳定在7.8 士。.2。标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少4 8 h，并尽可能检查稀释水中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质。例如:氯、重金属、农药、氨或多氯联苯。3.2.2 如果所进行的试验需要使用其他稀释水或改变稀释水的p H，应在试验报告中注明所用稀释水的性质。要求稀释水的硬度在1 5 0 -3 0 0 m g/L(以C a C O 3 计)范围内，C a/M g 比 例接近4 e 1,p H不得低于6.5 或不得高于8.5，同一试验p H波动不得大于。.5.3.3 重铬酸钾(K 2 C r 3 0,)，分析纯。4 试验液的制备4.1 试验物质溶液的配制4.1.1 试验物质可以是可溶于水的固 体、液体或气体，但要求组分一定，具有代表性、重复性。4.1.2 易溶于水的试验物质可直接加到稀释水里，也可以溶解在蒸馏水或去离子水中配成贮备液加人到稀释水中配成试验液，每升稀释水中的贮备液要少于1 0 m 1。贮备液应当低温保存。4.1.3 难溶于水的物质，可用适当的方法，将其溶解和分散。包括使用超声波装置及其他低毒溶剂增溶。如果使用溶剂，溶剂在试验液中的浓度不应超过。.5 m g/L，并应在试验的同时设两个对照组，一组用稀释水，另一组用最大浓度的溶剂。4.2 工业废水试验液的制备4.2.1 样品的采集及处理:采集废水样品时，应将采样瓶充满水样，不留空气。样品采集后应立即进行试验。如果样品采集后6 h 之内不能进行试验，则必需将水样冷冻保存(0-4 C)，并应尽可能缩短水样在试验前保存的时间。4.2.2 生产流程用水不稳定的工业废水.应在2 4 h 之内，每隔6 h 瞬时采样一次，分别测定每个样品，求得其最大毒性。4.2.3 废水样品可以用稀释水稀释配成不同浓度的试验液。5 试验容器和仪器5.1 试验容器可采用1 0 0 m L小烧杯或结晶皿等玻璃制品，加盖表面皿。的吸附，试验前可用低浓度试验溶液浸泡一天。试验结束后立即倒空容器液5.2 量筒、容量瓶、移液管、吸管、玻璃缸、尼龙筛网等器皿。5.3 溶解氧测定仪、p H计、温度计、电导仪。6 环境条件为防止玻璃容器对试验物质，刷洗、消除任何微量的试验6.1 试验温度要求基本稳定，变化不超过士I C验在 2 0 士1 或 2 5 士1 下进行。试验前的培养温度要求与试验温度基本一致。毒性试G a/T 1 3 2 6 6 一 9 16.2 实验在没有对大型蚤有害的气体、粉尘的大气条件下进行。6.3 试验在自 然光照或相当于自 然光照下进行(避免阳光直射)每天光照l o.h 左右。6.4 大型蚤在试验前应与试验条件一致的环境中驯养7 -1 0 d,6.5 试验操作及试验过程中 蚤类不能离开水，转移时要用玻璃滴管。了 预试验了.1 正式试验之前，为确定试验浓度范围，必须先进行预备试验。预备试验浓度间距可宽一些(如。.1,1,1 0)每个浓度至少放5 个幼蚤，通过预试验找出被测物使 1 0 0%大型蚤运动受抑制的浓度和最大耐受浓度的范围，然后在此范围内设计出正式试验各组的浓度。7.2 预试验中 应了 解毒物的稳定性，在标准稀释水中 是否会出现沉淀,p H等理化性质的改变。以 便确定正式试验是否需要采取流水或更换试验液及改变稀释水p H等措施。8 正式试验8.1 试验浓度的设计，根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按几何级数的 浓度系列(等比 级数间距)设计5 -7 个浓度(如1,2,4,8,1 6 等比级系数为2;又如1,1.8,3.2,5.6,1 0 等比级数系数为1.7 7 8)。试验浓度要设计合理，浓度系列中以能出现一个6 0%左右和4 0%左右大型蚤运动受抑制或死亡的浓度最为理想。8.2 试验用1 0 0 m L烧杯(或结晶皿)，装4 0 5 0 rn L试验液，置蚤1 0 个。每个浓度至少有2 一3 个平行。一组试验液设一空白对照，内装相等体积的稀释水。试验前要用化学方法测定试验液的初始浓度。8.3 试验开始后应于1,2,4,8,1 6 及2 4 h 定期进行观察，记录每个容器中 仍能活动的水蚤数，测定。一1 0 0%大型蚤不活动或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为。在计算试验蚤的不活动或死亡的百分数之后，立即测定试验液的溶解氧浓度。8.4 检查大型蚤的 敏感性及试验操作步骤的统一性，定期测定重铬酸钾的2 4 h-E C 5 0，目 的是验证大型蚤的敏感性。在试验报告中报告2 4 h-E C 5 o。重铬酸钾的2 4 h-E C 5 o 为。.5-1.2 p p m(2 0 条件下)。按照第8 章所叙述的步骤进行验证检查，如果重铬酸钾的2 4 h-E C 5 0 在。.5-1.2 p p m以 外，则应检查使用 试验步骤是否严格，并检查 大型蚤的培养方式。如有必要，使用新的符合敏感要求的 大型蚤品种。9 数据结果的处理及有效性9.1 E C 5 0(L C 5 0)的估算 试验结束，计算每个浓度中不活动的大型蚤或死亡蚤占试验总数的百分比，用概率单位目 测法，计算E C 5 o(或L C 5 0)(见附录C)。也可用计算机E C 5 0(或L C 5 0)程序处理(寇氏 修正法)，获得E C 5 0或 乙(5 0)。9.2 结果的表示 以2 4 h-E C 5。或4 8 h-E C 5 0 表示物质在相应时间内对大型蚤运动受抑制的影响。以2 4 h-L C 5 0 或4 8 h-L C 5。表示物质在相应时间内对大型蚤生存的影响。当浓度间距过近仍不能获得足够数据时，可采用使1 0 0%大型蚤活动受抑制或心脏停止跳动的最低浓度和使。%大型蚤活动受抑制或心脏停止 跳动的最高浓度来表示毒性影响的结果。检测排水时，以百 分数或毫升/升表示.检测化学物质时，以毫克/升表示。9.3 试验结果的有效性 符合下列条件的试验为结果有效。c a/r 1 3 2 6 6 一 9 1 a.对照组试验未出现不活动大型蚤。b.重铬酸钾的2 4 h-E C 5 0 在2 0 时为。.5-1.2 p p m的范围内。试验结束时溶解氧浓度必须大于或等于2 m g/L o d.必须经检测证明被测定的试验物质浓度保持于试验全过程(至少应为计划配制浓度的8 0%)0如果浓度偏差X2 0%，应以测试浓度结果为准。1 0 试验报告试验报告要求包括以下几个方面:a实验蚤的种名、来源、数目、蚤龄、饵料、驯养时间，对照组是否发生死亡。b.被测物质的化学性质、来源、样品的保存方法、保存时间及前处理方法。c.实验用稀释水的性质。d试验环境、水温、p H,D O、电导等情况。e试验条件下大型蚤的任何不正常行为，包括中毒症状。f.实 验结果、数据处理、结论、讨论。9.方法依据及参考文献。G s/T 1 3 2 6 6 一9 1 附录A大型蚤的培养繁殖方法 (补充件)A 1 试验蚤的选育 试验蚤(D a p h n i a m a g n a)可以 从其他试验室已有的纯培养中挑取、引种，也可以从野外采集。野外采集的蚤要经分离、纯化，在显微镜下鉴定后，选择体大、健康的母体数个，用5 0 m L小烧杯单个培养。选择繁殖量最大的一代为母蚤，单克隆化，使之成为纯品系。A 2 饵料 雌性的大型蚤可以 在2 0 生存4 个月之久。蚤类喜食藻类、细菌、醉母及有机物碎屑等。藻类的营养价值高于其他食物，本方法推荐用实验室培养的栅藻为大型蚤的饵料。栅藻的培养方法见附录B.A 3 容器 单个培养母蚤可用5 0 m L小烧杯，梦殖培养用2 0 0 0 m L 大烧杯，储备培养用3 0 e m X 3 0 c m圆 玻璃缸，或类似大小的水簇箱。A 4 喂养 用不含无机培养剂的栅藻扩大培养液喂养大型蚤。可以采用每周3 次全部更换水蚤培养液的办法，也可以每天追加一次浓缩悬浮藻液。培养液中 栅藻的浓度不宜过高，一般在1 0 6 个/L 左右，藻液的颜色以淡苹果绿色为宜。否则晚间缺氧会引起大型蚤的死亡。A 5 培养条件 氯气对大型蚤生存不利，培养用水可选用经自 然曝气三夭以上的自 来水或人工配制的稀释水，大型蚤生存的适宜温度为1 1 士 2 5 t，适宜的p H为6.5-8.5。大型蚤的密 度以每升水中培养5 0 个左右母蚤为宜。过分拥挤，会造成大型蚤停止孤雌生殖。大型蚤对氧有较强的适应能力，培养液中可保持2 m g/I以上的溶解氧。A 6 实验蚤的分离 大型蚤的生长是间歇性的、生长与脱壳交替进行。每脱壳一次，增加一龄，前后脱壳的时间叫 龄期。性成熟前的龄期为幼龄蚤，性成熟后的为成龄蚤。大型蚤有4-6 个幼龄期，幼龄蚤比 成龄蚤对毒物更敏感。运动受抑制试验一般选用实验