GB 5009.210-2016 食品安全国家标准 食品中泛酸的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 6食品安全国家标准食品中泛酸的测定2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 3-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.2 1 02 0 0 8 食品中泛酸的测定、G B5 4 1 3.1 72 0 1 0 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定。本标准与G B/T5 0 0 9.2 1 02 0 0 8相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中泛酸的测定”;增加了高效液相色谱方法;修改了食品的前处理方法;增加了检出限和定量限。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 食品安全国家标准食品中泛酸的测定1 范围本标准规定了食品中泛酸和泛酸钙的测定方法。本标准第一法适用于食品中泛酸的测定,第二法适用于营养素补充剂类保健食品和配方食品中泛酸(钙)的测定。第一法 微生物法2 原理泛酸是植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)生长所必需的营养素,在一定控制条件下,将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中,培养一定时间后测定透光率(或吸光度值),根据泛酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。3 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 盐酸(HC l)。3.1.2 冰乙酸(C2H4O2)。3.1.3 氢氧化钠(N a OH)。3.1.4 氯化钠(N a C l)。3.1.5 碳酸钠(N a2C O3)。3.1.6 碳酸氢钾(KHC O3)。3.1.7 磷酸氢二钾(K2H P O4)。3.1.8 三水合乙酸钠(C2H3O2N a3 H2O)。3.1.9 三水合磷酸二氢钾(KH2P O43 H2O)。3.1.1 0 七水合硫酸镁(M g S O47 H2O)。3.1.1 1 七水合硫酸亚铁(F e S O47 H2O)。3.1.1 2 一水合硫酸锰(M n S O4H2O)。3.1.1 3 三羟甲基氨基甲烷(C4H1 1NO3)。3.1.1 4 葡萄糖(C6H1 2O6)。3.1.1 5 甲苯(C7H8)。3.1.1 6 无水乙醇(C2H6O)。3.1.1 7 阴离子交换树脂D o w e x18:粒度3 8m 7 5m。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 62 3.1.1 8 碱性磷酸酶:酶活力2 3U/g。3.1.1 9 鸽子肝脏丙酮提取物干粉(l i v e ra c e t o n ep o w d e r,f r o mp i g e o n):酶活力0.1U/g。3.1.2 0 蛋白胨:含氮量1 0%。3.1.2 1 酵母提取物:含氮量1 0%。3.1.2 2 琼脂。3.2 试剂配制3.2.1 乙酸溶液(0.2m o l/L):吸取1 1.8m L冰乙酸,用水稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.2 乙酸钠溶液(0.2m o l/L):称取2 7.2g三水合乙酸钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.3 盐酸溶液(1m o l/L):吸取8 3m L盐酸,加水稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.4 盐酸浸泡液:吸取1 0 0m L盐酸与5 0倍水混合。3.2.5 氢氧化钠溶液(1m o l/L):称取4 0g氢氧化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.6 氢氧化钠溶液(0.1m o l/L):称取4g氢氧化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.7 T r i s缓冲液:称取1 2 1.0g三羟甲基氨基甲烷溶于5 0 0m L水中,用冰乙酸调p H至8.10.1,加水至10 0 0m L,混匀。贮存于24冰箱中,可保存2周。3.2.8 生理盐水:称取9g氯化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。临用前预先灭菌,于1 2 1高压灭菌1 0m i n后备用。3.2.9 乙醇溶液(2 0%):量取2 0 0m L无水乙醇与8 0 0m L水混匀。3.2.1 0 碳酸钠溶液(0.0 8m o l/L):称取8.5g碳酸钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.1 1 碳酸氢钾溶液(0.0 2m o l/L):称取2g碳酸氢钾,加水溶解并稀释至10 0 0m L。混匀。3.2.1 2 碱性磷酸酶溶液:称取2g碱性磷酸酶,加水溶解并稀释至1 0 0m L。临用现配,24冰箱预冷。3.2.1 3 鸽子肝脏提取液3.2.1 3.1 活化D o w e x18:称取1 0 0gD o w e x18于锥形瓶中,加入1L盐酸溶液,置于振荡器上充分振摇1 0m i n,用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。D o w e x18转回锥形瓶,再加入1L盐酸溶液重复振摇、过滤。D o w e x18加入1L水振摇1 0m i n,过滤,重复用水洗涤1 0次。逐滴加入T r i s缓冲液调节D o w e x18p H至8.00.1。24冰箱保存,2天内用完。3.2.1 3.2 鸽子肝脏提取液:配制此试剂前一天将所用容器放入24冰箱中冷藏过夜。称取3 0g鸽子肝脏丙酮提取物干粉,放入研钵中,冰浴条件下分两次加入3 0 0m L碳酸氢钾溶液研磨至匀浆,转入具塞离心管中,盖好塞后充分振摇,-2 0冷冻1 0m i n后以30 0 0r/m i n离心5m i n,将上清液转至5 0 0m L广口瓶中。加1 5 0g活化D o w e x18,放入冰浴中混匀5 m i n,将混合液倒入离心管中,30 0 0r/m i n离心5m i n。将上清液移入另一5 0 0m L预冷的广口瓶中,-2 0冷冻1 0m i n,再加1 5 0g活化D o w e x18,放入冰浴中混匀5m i n,将混合液倒入离心管中,30 0 0r/m i n离心,将上清液分装于具塞试管中(每管大约3m L),-2 0冷冻保存。用前于24冰箱内化冻并保存至用时。3.3 培养基3.3.1 甲盐溶液:分别称取2 5g磷酸氢二钾和2 5g三水合磷酸二氢钾,加水溶解并稀释至5 0 0m L,混匀。加入1m L甲苯,24冰箱可保存1年。3.3.2 乙盐溶液:分别称取1 0g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰,加水溶解并稀释至5 0 0m L。加5滴盐酸,24冰箱可保存1年。3.3.3 琼脂培养基:按表1称取或吸取各试剂,加水至1 0 0m L,混合,沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1m o l/L盐酸溶液和/或1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至6.80.1。尽快分装,根据试管内径粗细加入3m L5m L,液面高度不得低于2c m。塞上棉塞,1 2 1高压灭菌1 5m i n。取出后试管直立放G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 63 置,待冷却后于冰箱内保存,备用。表1 菌种储备用琼脂培养基配制一览表试剂用量葡萄糖1.0g蛋白胨0.8g酵母提取物干粉0.2g三水合乙酸钠1.7g甲盐溶液0.2m L乙盐溶液0.2m L琼脂1.2g3.3.4 泛酸测定用培养液:可按附录A配制泛酸测定用培养液。也可直接由试剂公司购买效力相当的泛酸测定用培养基,用前按说明书配制。3.4 标准品D-泛酸钙(C1 8H3 2C a N2O1 0):纯度9 9%。3.5 标准溶液的配制3.5.1 泛酸标准储备溶液(4 0.0g/m L):精确称取4 3.5m g预干燥至恒重的D-泛酸钙,加水溶解并转移至10 0 0m L容量瓶中,加1 0m L乙酸溶液,1 0 0m L乙酸钠溶液,用水定容至刻度。储存于棕色瓶中,加入3滴5滴甲苯,于24冰箱中可保存2年。3.5.2 泛酸标准中间液(1.0 0g/m L):准确吸取2 5.0m L泛酸标准储备溶液置于10 0 0m L容量瓶中,加入1 0m L乙酸溶液,1 0 0m L乙酸钠溶液,用水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯于24冰箱中可保存1年。3.5.3 泛酸标准工作溶液(2 0n g/m L):准确吸取2.0 0m L泛酸标准中间溶液置于1 0 0m L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。临用前现配。4 仪器和设备4.1 天平:感量0.1m g。4.2 恒温培养箱:3 71。4.3 压力蒸汽消毒器:1 2 1。4.4 漩涡振荡器。4.5 离心机:转速30 0 0r/m i n。4.6 接种针和接种环。4.7 p H计:精度0.0 1。4.8 紫外-分光光度计。4.9 超净工作台。4.1 0 超声振荡器。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 64 5 菌种的制备与保存5.1 菌种植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)。5.2 储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)转接至琼脂培养基中,在3 71恒温箱中培养2 0h2 4h,连续传种2次3次。取出后放入24冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次,不宜超过2 5代。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中,3 71恒温培养箱中培养2 0h2 4h以活化菌株,用于接种液的制备。注:保存数周以上的储备菌株,不能立即用作接种液制备,试验前宜连续传种2代3代以保证细菌活力。5.3 接种液的制备试验前一天,取2m L泛酸标准工作溶液和4m L泛酸测定用培养液混匀,分装于2支5m L离心管中,塞好棉塞,于1 2 1高压灭菌1 5m i n后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中,于3 71恒温培养箱中培养2 0h2 4h。取出后30 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃上清液,无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗2次,30 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃上清液。再加入3m L灭菌生理盐水,振荡混匀,制成接种液,立即使用。6 分析步骤注:所有操作均需避光进行6.1 试样制备谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm0.5mm);肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前振摇混合。4冰箱可保存1周。6.2 试样提取6.2.1 直接提取法形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料,添加了泛酸钙的配方食品或保健食品可采用直接提取法。准确称取适量试样(m),固体试样0.2g 2g;液态试样5g 1 0g,精确至0.0 0 1g,转入1 0 0m L锥形瓶中,加入8 0m L乙醇溶液,具塞,超声振摇提取4h以上至试样完全溶解,用水定容至1 0 0m L(V1)。6.2.2 酶解法一般谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。6.2.2.1 水解:准确称取适量试样(m,约含0.0 2m g0.2m g泛酸),精确至0.0 0 1g。一般谷薯类、肉类、蛋类、豆类及其制品称取1g5g;新鲜果蔬、乳及其制品称取5g1 0g。转入至1 0 0m L锥形瓶中,加1 0m LT r i s缓冲液、4 0m L水,振荡混匀。于1 2 1高压条件下水解1 5m i n。冷却至室温,转移G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 65 至1 0 0m L容量瓶中,用水定容至刻度(V1),过滤。6.2.2.2 酶解:准确吸取适量试样滤液(1.0m L1 0.0m L,V2)至2 5m L具塞刻度试管底部,补水至1 0m L,加5m LT r i s缓冲液。在冰浴条件下,依次小心加入预冷的0.1m L碳酸氢钠溶液、0.4m L碱性磷酸酶溶液、0.2m L鸽子肝脏提取液和0.4m L水。小心混匀试管,避免混合物黏附于试管壁,