GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GBGBGBGB 4789.52012食品安全国家标准食品微生物学检验 志贺氏菌检验中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部发布2012-05-17 发布2012-07-17 实施GB 4789.5-2012I前言本标准代替GB/T 4789.5-2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验。本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比，主要变化如下：修改了标准名称；修改了培养基和试剂；修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分；修改了表2；修改了表4。GB 4789.5-20122食品安全国家标准食品微生物学检验 志贺氏菌检验1范围本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36 1；b）冰箱：2 5；c）膜过滤系统；d）厌氧培养装置：41.5 1；e）电子天平：感量 0.1 g；f）显微镜：10100；g）均质器；h）振荡器；i）无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；j）无菌均质杯或无菌均质袋：容量 500 mL；k）无菌培养皿：直径 90 mm；l）pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；m）全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录 A 中 A.1。3.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A 中 A.2。3.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.3。3.4 志贺氏菌显色培养基。3.5 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.4。3.6 营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.5。3.7 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。3.8 葡萄糖铵培养基：见附录 A 中 A.7。3.9 尿素琼脂：见附录 A 中 A.8。GB 4789.5-201233.10-半乳糖苷酶培养基：见附录 A 中 A.9。3.11 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.10。3.12 糖发酵管：见附录 A 中 A.11。3.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A 中 A.12。3.14 粘液酸盐培养基：见附录 A 中 A.13。3.15 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.14。3.16 志贺氏菌属诊断血清。3.17 生化鉴定试剂盒。4 检验程序志贺氏菌检验程序见图 1。GB 4789.5-20124图 1 志贺氏菌检验程序5操作步骤5.1 增菌以无菌操作取检样 25 g（mL），加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质 1 min2 min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5，厌氧培养 16 h20 h。5.2 分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于 36 1 培养 20 h24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48 h 再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。36，20 h48 hXLD挑取可疑菌落TSI，半固体，营养琼脂斜面MAC 或志贺氏菌显色培养基生化鉴定报告血清学分型志贺氏菌属分群及分型结果检样25 g（或 25 mL）样品+志贺氏菌增菌肉汤 225 mL41.5，16 h20 h 厌氧培养GB 4789.5-20125表 1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板志贺氏菌的菌落特征MAC 琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐XLD 琼脂粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐志贺氏菌显色培养基按照显色培养基的说明进行判定5.3 初步生化试验5.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36 1 培养20 h24 h，分别观察结果。5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。5.4 生化试验及附加生化试验5.4.1 生化试验用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型，鲍氏志贺氏菌 13 型的-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。表 2 志贺氏菌属四个群的生化特征生化反应A 群：痢疾志贺氏菌B 群：福氏志贺氏菌C 群：鲍氏志贺氏菌D 群：宋内氏志贺氏菌-半乳糖苷酶aa尿素赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶b水杨苷七叶苷靛基质/()/甘露醇c棉子糖甘油()()d注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d 表示有不同生化型。a痢疾志贺 1 型和鲍氏 13 型为阳性。b鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性。c福氏 4 型和 6 型常见甘露醇阴性变种。5.4.2 附加生化实验由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 培养 24 h48 h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。GB 4789.5-20126表 3 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别生化反应A 群：痢疾志贺氏菌B 群：福氏志贺氏菌C 群：鲍氏志贺氏菌D 群：宋内氏志贺氏菌大肠埃希氏菌A-D 菌葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐dd粘液酸盐dd注 1：+表示阳性；-表示阴性；d 表示有不同生化型。注 2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.5 血清学鉴定5.5.1抗原的准备志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O 抗原又可分为型和群的特异性抗原。一般采用 1.2%1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。注 1：一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液，100 煮沸 15 min60 min 去除 K 抗原后再检查。注 2：D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。5.5.2 凝集反应在玻片上划出 2 个约 1cm2cm 的区域，挑取一环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按 5.5.1 注 1 进行试验。5.5.3 血清学分型（选做项目）先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B 群福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集，则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其相和相血清检查；如果 B、D 群多价血清都不凝集，则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 112 各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用 118 各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表 4。表 4 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表型和亚型型抗原群抗原在群因子血清中的凝集3,467,81a4+-1b（4），6(+)+-2a3,4+-2b7,8-+GB 4789.5-20127表 4（续）福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表型和亚型型抗原群抗原在群因子血清中的凝集3,467,83a（3，4）,6,7,8(+)+3b（3,4）,6(+)+-4a3,4+-4b6-+-4c7,8-+5a（3,4）(+)-5b7,8-+64+-X-7,8-+Y-3,4+-注：+表示凝集；-表示不凝集；（）表示有或无。5.6 结果报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。GB 4789.5-20128附录A培养基和试剂A.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素（Shigellabroth）A.1.1 志贺氏菌增菌肉汤A.1.1.1 成分胰蛋白胨20.0 g葡萄糖1.0 g磷酸氢二钾2.0 g磷酸二氢钾2.0 g氯化钠5.0 g吐温 80（Tween 80）1.5 mL蒸馏水1 000.0 mLA.1.1.2 制法将以上成分混合加热溶解，冷却至25 左右校正pH至7.00.2，分装适当的容器，121 灭菌15 min。取出后冷却至 50 55，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5 g/mL），分装 225 mL 备用。注：如不立即使用，在 2 8 条件下可储存一个月。A.1.2 新生霉素溶液A.1.2.1 成分新生霉素25.0 mg蒸馏水1 000.0 mLA.1.2.2 制法将新生霉素溶解于蒸馏水中，用 0.22 m 过滤膜除菌，如不立即使用，在 2 8 条件下可储存一个月。A.1.3 临用时每 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤（A.1.1）加入 5 mL 新生霉素溶液（A.1.2），混匀。A.2 麦康凯（MAC）琼脂A.2.1 成分蛋白胨20.0 g乳糖10.0 g3 号胆盐1.5 g氯化钠5.0 g中性红0.03 g结晶紫0.001 g琼脂15.0 g蒸馏水1 000.0 mLA.2.2 制法将以上成分混合加热溶解，冷却至 25 左右校正 pH 至 7.20.2，分装，121 高压灭菌 15 min。冷却至 45 50，倾注平板。注：如不立即使用，在 2 8 条件下可储存二周。A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂A.3.1 成分GB 4789.5-20129酵母膏3.0 gL-赖氨酸5.0 g木糖3.75 g乳糖7.5 g蔗糖7.5 g脱氧胆酸钠1.0 g氯化钠5.0 g硫代硫酸钠6.8 g柠檬酸铁铵0.8 g酚红0.08 g琼脂15.0 g蒸馏水1 000.0 mLA.3.2 制法除酚红和琼