GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB 4789.42010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 National food safety standard Food microbiological examination:Salmonella 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施GB 4789.42010 I 前 言 本标准代替 GB/T 4789.4-2008食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验。本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的范围；修改了培养基和试剂；修改了设备和材料；修改了附录 A。本标准的附录 A、附录B 为规范性附录。本标准所代替的历次版本发布情况为：GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。GB 4789.42010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2 5。2.2 恒温培养箱：36 1，42 1。2.3 均质器。2.4 振荡器。2.5 电子天平：感量 0.1 g。2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。2.9 无菌试管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。2.10 无菌毛细管。2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。2.12 全自动微生物生化鉴定系统。3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录 A 中 A.1。3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中 A.2。3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中 A.3。3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录 A 中 A.4。3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.6。GB 4789.42010 2 3.7 沙门氏菌属显色培养基。3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.7。3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。3.10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录 A 中 A.9。3.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录 A 中 A.10。3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。3.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。3.14 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录 A 中 A.13。3.15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。3.16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。3.18 生化鉴定试剂盒。GB 4789.42010 3 4 检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1。图 1 沙门氏菌检验程序 5 操作步骤 5.1 前增菌 称取 25 g（mL）样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min10 000 r/min 均质1 min2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.80.2。检样 36 1，8 h18 h TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素(pH 7.2)，KCN 挑取可疑菌落 BS XLD（或 HE、显色培养基）1 mL+TTB 10 mL 1 mL+SC 10 mL 25 g（mL）样品+225 mLBPW H2S+靛 基 质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛 基 质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-反应结果与左侧描述不符 生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+42 1，18 h24 h 36 1，18 h24 h 36 1，40 h48 h 36 1，18 h24 h 甘露醇+、山梨醇+ONPG-报告非沙门氏菌 沙门氏菌，血清学试验 GB 4789.42010 4 无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 1 培养 8 h18h。如为冷冻产品,应在 45 以下不超过 15 min,或 2 5 不超过 18 h 解冻。5.2 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 1 培养 18 h24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 1 培养 18 h24 h。5.3 分离 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 1 分别培养 18 h24 h（XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或 40 h48 h（BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 BS 琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD 琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 1 培养 18 h24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 赖氨酸脱羧酶试验培养基 K A（）（）可疑沙门氏菌属 K A（）（）可疑沙门氏菌属 A A（）（）可疑沙门氏菌属 A A/非沙门氏菌 K K/非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性。5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 1 培养 18 h24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 5 或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。GB 4789.42010 5 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢（H2S）靛基质pH 7.2 尿素氰化钾 （KCN）赖氨酸脱羧酶 A1 A2 A3 /注：阳性；阴性；/阳性或阴性。5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。如有 2 项异常为非沙门氏菌。表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN）赖氨酸 脱羧酶 判 定 结 果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：表示阳性；表示阴性。5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项 目 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN 注：表示阳性;表示阴性。5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备 一般采用 1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 23）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰GB 4789.42010 6 上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.30.4半固体琼脂的小玻管 1 次2次，自远端取菌培养后再检查。5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定 同 5.5.2。5.5.4 血清学分型（选做项目）5.5.4.1 O 抗原的鉴定 用 AF 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被 AF 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。不被 AF 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下：O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群（并包括 6,14 群）O 多价 2 13，16，17，18，21 群 O 多价 3 28，30，35，38，39 群 O 多价 4 40，41，42，43 群 O 多价 5 44，45，47，48 群 O 多价 6 50，51，52，53 群 O 多价 7 55，56，57，58 群 O 多价 8 59，60，61，62 群 O 多价 9 63，65，66，67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定 属于 AF 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。表 6 AF 群常见菌型 H 抗原表 O 群 第 1 相 第 2 相 A B B C1 C2 D（不产气的）D（产气的）E1 E4 E4 a g,f,s i,b,d k,v,r,c b,d,r d g,m,p,q h,v g,s,t i 无 无 2 5,z15 2,5 无 无 6,w,x 无 GB 4789.42010 7 不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检