GBT 16551-2008 猪瘟诊断技术.pdf

ICS 11.220B41GB中华人民共和国国家标准GB/T16551-2008代替GB16551-1996猪瘟诊断技术Diagnostic techniques for classical swine fever(hog cholera)2008-12-31发布2009-05-01实施标准出中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局=中国国家标准化管理委员会发布GB/T16551-2008成20%悬液，加青霉素（使最终浓度为500U/mL)和链霉素（使最终浓度为500g/mL),室温下放置1h,以3000r/min离心15min取用上清液。3.3.2将PK1单层细胞用胰酶消化分散后，以800r/min离心10min,用不含牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5%胎牛血清的MEM配成每毫升含2106个细胞的悬液。3.3.3九份细胞悬液(3.3.2)加一份病料悬液(3.3.1)接种于带有细胞飞片的转瓶或微量细胞培养板。另设不加病料的对照若干瓶（孔），于接种后1d、2d、3d,分别从两个接种瓶（孔）和一个对照瓶（孔）中取出细胞片用Hanks液或MEM洗涤两次，每次5min,用冷无水丙酮固定10min。3.3.4按3.2或3.4.53.4.7进行免疫酶染色或荧光抗体染色、镜检并判定结果。3.4直接免疫荧光抗体试验3.4.1采样群体检疫中，待检可疑猪不少于三例，其中至少两例为早期患猪，活体取扁桃体或剖杀后摘取扁桃体。后期病猪剖杀后采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。个体检疫时，可活体取扁桃体或剖杀可疑猪采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。所采组织样品应新鲜且为猪瘟疫苗免疫21d之后。3.4.2送检采样后应尽快冷藏送检，如当日不能送出，应冻结保存，避免组织腐败、自溶，影响结果。3.4.3制片将样品组织块修切出1cm1cm的小块，不经任何固定处理，直接冻贴于冰冻切片机的冰冻切片托上（组织块太小时，如活体采取的扁桃体，可用冰冻切片机专用的包埋剂或化学浆糊包埋），进行切片，切片厚度要求5m7m。将切片展贴于0.8mm1.0mm厚的洁净载玻片上，也可将样片组织直接作压印片或涂片，同时设正常对照片。3.4.4固定将切片、压印片或涂片置无水丙酮中固定15min。取出立即放入0.01mol/L,pH7.2的磷酸缓冲盐水中，轻轻漂洗3次。取出，自然干燥后，尽快进行荧光抗体染色。3.4.5荧光抗体染色将猪瘟荧光抗体滴加于样品片表面，放置湿盒内于37作用30min。取出后浸入磷酸缓冲盐水中充分漂洗，再用带有0.5mol/L,pH9.0pH9.3碳酸盐缓冲甘油的盖玻片(0.17mm厚)封固样品片表面。染色后应尽快镜检，4保存不应超过72h。必要时可低温保存待检，但也不应超过一周。3.4.6镜检将染色、封固后的样品片置于激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。3.4.7判定标准于荧光显微镜视野中，见扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，或脾、淋巴结胞浆内有黄绿色荧光判为猪瘟病毒感染阳性。正常对照片细胞内应无黄绿色荧光。3.5猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)3.5.1材料与样品准备3.5.1.1材料准备本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器应经干烤灭菌。3.5.1.2样品制备按1：5（质量浓度）比例，取待检组织和MEM液于研钵中充分研磨制成匀浆液，4，以1000g离心15min,取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其他样品的情处理。制备的样品在28保存不应超过24h,长期保存应小分装后置-70以下，避免反复冻融。同时设阴、阳性样品对照。3