GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.4 12 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 肠杆菌科检验2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 3-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B4 7 8 9.4 12 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验 肠杆菌科检验1 范围本标准规定了食品中肠杆菌科(E n t e r o b a c t e r i a c e a e)的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。2 术语和定义2.1肠杆菌科 E n t e r o b a c t e r i a c e a e在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2肠杆菌科计数 E n u m e r a t i o no fE n t e r o b a c t e r i a c e a e按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。2.3最可能数 m o s tp r o b a b l en u m b e r;MP N基于泊松分布的一种间接计数方法。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱:3 61。3.2 冰箱:25。3.3 水浴箱:4 61。3.4 天平:感量0.1g。3.5 显微镜:1 0倍1 0 0倍。3.6 均质器。3.7 振荡器。3.8 无菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头。3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量1 5 0m L、5 0 0m L。3.1 0 无菌培养皿:直径9 0mm。3.1 1 无菌试管:1 8mm1 8 0mm、1 5mm1 5 0mm。3.1 2 p H计或p H比色管或精密p H试纸。4 培养基和试剂4.1 缓冲蛋白胨水(B PW):见B.1。G B4 7 8 9.4 12 0 1 62 4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(E E肉汤):见B.2。4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(V R B GA):见B.3。4.4 营养琼脂(NA):见B.4。4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。4.6 革兰氏染色液:见B.6。4.7 氧化酶试剂:见B.7。4.8 无菌1m o l/LN a OH:见B.8。4.9 无菌1m o l/LHC l:见B.9。第一法 肠杆菌科平板计数法5 检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。图1 肠杆菌科平板计数法检验程序G B4 7 8 9.4 12 0 1 63 6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品:称取2 5g样品放入盛有2 2 5m LB PW的无菌均质杯中,80 0 0r/m i n1 00 0 0r/m i n均质1m i n2m i n,或放入盛有2 2 5 m LB PW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n 2m i n,制成11 0的样品匀液。6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取2 5m L样品放入盛有2 2 5m LB PW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成11 0的样品匀液。6.1.3 用1m L无菌吸管或微量移液器吸取11 0样品匀液1m L,沿管壁缓缓注入盛有9m LB PW的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成11 0 0的样品匀液。6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成1 0倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过1 5m i n。6.2 倾注平板和培养6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1m LB PW加入两个无菌平皿内作为空白对照。6.2.2 将1 0m L1 5m L冷却至4 6的V R B GA(可放置于4 61恒温水浴箱中保温)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。6.2.4 待V R B GA平板上层琼脂凝固后翻转平板,3 61培养1 8h2 4h。6.3 典型菌落计数和确认6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在1 5C F U1 5 0C F U之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌 落形成单位(c o l o n y-f o r m i n gu n i t s,C F U)表示。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。6.3.5 典型菌落的确认:a)分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,3 61培养1 8h2 4h,挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。b)革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.31.0)m(1.06.0)m。c)氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂G B4 7 8 9.4 12 0 1 64 的滤纸上,滤纸的颜色在1 0s内变成蓝紫色,判为阳性反应。d)葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于3 61培养2 4h2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。6.4 结果的计算6.4.1 一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见A.1、A.2、A.3、A.4。N=a(n1+0.1n2)d(1)式中:N 样品中肠杆菌科菌落数;a 确证的肠杆菌科菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);d 稀释因子(第一稀释度)。其中,a按式(2)计算:a=bAC(2)式中:a 确证的肠杆菌科菌落数;b 某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,bA;A 某一平板中用于确认试验的菌落数;C 某一平板中典型菌落总数。6.4.2 低菌落数若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于1 5C F U,具有确证的肠杆菌科菌落,则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于1 5C F U,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6.4.3 特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于1 5 0C F U,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在1 5C F U1 5 0C F U之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,示例见A.5。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7 报告7.1 菌落数小于1 0 0时,以整数报告。7.2 菌落数大于或等于1 0 0时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用1 0的指数形式来表示,采用两位有效数字。7.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。G B4 7 8 9.4 12 0 1 65 7.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.6 称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告。第二法 肠杆菌科MP N计数法8 检验程序肠杆菌科MP N计数法检验程序见图2。图2 肠杆菌科MP N计数法检验程序G B4 7 8 9.4 12 0 1 66 9 操作步骤9.1 样品的稀释按6.1进行。9.2 接种和培养9.2.1 非选择性前增菌根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度3管,共9管B PW于3 6 1培养1 8h2h。9.2.2 选择性增菌从B PW各培养管中,分别移取1m L培养物,接种于1 0m L的E E肉汤中,3 61培养2 4h2h。9.2.3 分离用接种环从E E各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于V R B GA平板,3 61培养2 4h2h,观察平板上有无典型菌落。9.3 典型菌落的确认典型菌落确认见6.3。1 0 报告肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌科,其所代表的E E管即为肠杆菌科阳性,依据E E阳性管数查MP N表(见附录C),报告每克(毫升)样品中肠杆菌科的MP N值。称重取样以MP N/g为单位报告,体积取样以MP N/m L为单位报告。G B4 7 8 9.4 12 0 1 67 附 录 A结果计算示例A.1 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表A.1。表A.1 肠杆菌科平板计数结果示例1稀释度11 0 0(第一稀释度)110 0 0(第二稀释度)典型菌落数/C F U1 2 61 4 52 02 4用于确认试验的菌落数/C F U5555确证的菌落数/C F U4543a4/51 2 6=1 0 15/51 4 5=1 4 54/52 0=1 63/52 4=1 4N=1 0 1+1 4 5+1 6+1 42+(0.12)1 0-2=2 7 60.0 2 2=1 25 4 5 上述数据按7.2数字修约后,表示为1 30 0 0或1.31 04。A.2 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.2。表A.2 肠杆菌科平板计数结果示例2稀释度11 0 0(第一稀释度)110 0 0(第二稀释度)典型菌落数/C F U1 2 61 1 82 01 0用于确认试验的菌落数/C F U585确证的菌落数/C F U454a4/51 2 6=1 0 15/81 1 8=7 44/52 0=1 6N=1 0 1+7 4+1 62+(0.11)1 0-2=1 9 10.0 2 1=90 9 5 上述数据按7.2数字修约后,表示为91 0 0或9.11 03。A.3 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.3。表A.3 肠杆菌科平板计数结果示例3稀释度11 0 0(第一稀释度)110 0 0(第二稀释度)典型菌落数/C F U1 2 61 1 82 02 0用于确认试验的菌落数/C F U5655确证的菌落数/C F U4640a4/51 2 6=1 0 16/61 1 8=1 1 84/52 0=1 60N=1 0 1+1 1 8+1 6+02+(0.11)1 0-2=2 3 50.0 2 1=1 11 9 0 上述数据按7.2数字修约后,表示为1 10 0 0或1.11 04。G B4 7 8 9.4 12 0 1 68 A.4 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。A.5 第一稀释度平板上的菌落数超过1 5 0C F U,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不