GB 4789.31-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 GB 4789.312013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验 2013-11-29 发布 2014-06-01 实施 GB 4789.312013 I 前 言 本标准代替 GB/T 4789.31-2003食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法。本标准与 GB/T 4789.31-2003 相比,主要变化如下：修改了操作步骤；增加了附录 B。GB 4789.312013 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的 肠杆菌科噬菌体诊断检验 1 范围 本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌、培养的设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36 1,42 1，50 1;b)厌氧培养装置：41.5 0.5;c)显微镜：10 倍100 倍;d)水平仪：噬菌体试验的工作台面应调整至水平位置;e)已灭菌 1 mL 一次性注射器（应为塑料材质），针头无编号，使用前测定每滴 5 L10 L（每 mL 有 100200 滴）可用;f)微量移液器及吸头（10 L 和 5 L）;g)定量移液器及吸头（100 L 和 50 L）;h)无菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL;i)无菌毛细管;j)无菌培养皿：90 mm;k)无菌棉签;l)带盖的灭菌小试管：8 mm50 mm;m)载物玻片。3 培养基和试剂 3.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中的 A.1。3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中的 A.2。3.3 志贺氏菌（BCT）增菌液：见附录 A 中的 A.3。3.4 营养肉汤（NB）：见附录 A 中的 A.4。3.5 营养琼脂（NA）：见附录 A 中的 A.5。3.6 营养半固体琼脂（NSA）：见附录 A 中的 A.6。GB 4789.312013 2 3.7 三糖铁琼脂（TSI）：见附录 A 中的 A.7。3.8 葡萄糖铵琼脂：见附录 A 中的 A.8。3.9 肠杆菌科诊断用噬菌体，7 种和 3 种。必要时可再购置大肠埃希氏菌分型噬菌体（6 种）一套。安瓿开启后用无菌毛细管吸出移入灭菌小试管内，如果每次使用量很少，可分装于 23 支试管内，保存于5 冰箱备用。3.10 沙门氏菌因子血清，志贺氏菌分型因子血清，致泻大肠埃希氏菌分型因子血清。因子血清的种类视需要而定。4 检验程序 4.1 沙门氏菌的检验程序 沙门氏菌的检验程序见图 1。GB 4789.312013 3 图 1 沙门氏菌的检验程序 4.2 志贺氏菌的检验程序 志贺氏菌的检验程序见图 2。ONPG 甘露醇、山梨醇 检 样 O-1 裂解 其他均不裂解 非如左述的 各种反应结果 沙门氏菌 血清学试验证实 非沙门氏菌 沙门氏菌 血清学试验证实 沙门氏菌 血清学试验证实 非沙门氏菌 非沙门氏菌 报 告 前增菌、增菌和分离 挑取可疑菌落 TSI(斜面、底面、产气、H2S)蛋白胨水（靛基质）尿素（pH7.2）,KCN,赖氨酸 H2S+,靛基质，尿素，KCN，赖氨酸 噬菌体试验 H2S+，靛基质+，尿素，KCN，赖氨酸+各种噬菌体 均不裂解 非如左述的 各种裂解结果 H2S，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸+/,+GB 4789.312013 4 图 2 志贺氏菌的检验程序 Sh 裂解，并呈现 各种裂解模式 Sh 不裂解 血清学试验与裂解模式相符 且被 1 RTD Sh 裂解 血清学试验与裂模式不相符 或不被 1 RTD Sh 裂解 生化分群试验 葡萄糖铵试验 必要时加做乙酸钠、克氏柠檬酸盐、黏液酸、七叶苷、水杨苷试验 志贺氏菌属 分群及分型结果 葡萄糖铵+或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 报 告 非志贺氏菌 非志贺氏菌 噬菌体试验 非如左述的各种反应结果 检 样 挑取可疑菌落 TSI，葡萄糖半固体 增菌和分离 TSI 底层产酸,斜面产碱，H2S 不产气，无动力 GB 4789.312013 5 4.3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序 致泻大肠埃希氏菌的检验程序见图 3。图 3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序 检 样 E 和或 Sh、E4 噬菌体不裂解 其他噬菌体裂解 不同来源分离的菌株 其裂解模式具有同一性 TSI，靛基质，pH7.2 尿素，KCN,赖氨酸，动力 TSI 底层，H2S,KCN，尿素 非如左述 各种反应结果 血清学试验 ETEC+增菌和分离 E 和或 Sh、E4 噬菌体裂解 各种噬菌体均不裂解 氧化酶，G杆菌 EPEC+产肠毒素 大肠埃希氏菌 非大肠 埃希氏菌 赖氨酸，靛基质+，动力(O124 动力+/)肠毒素+EIEC+非如左述 各种反应结果 非大肠 埃希氏菌 非致泻大 肠埃希氏菌 肠道侵袭性 大肠埃希氏菌 肠道致病性 大肠埃希氏菌 乳糖发酵或不发酵 的菌落 35 个 噬菌体试验 STEC(O157)stx1,stx2,hly+产志贺毒素 大肠埃希氏菌 eae+报告 GB 4789.312013 6 5 操作步骤 5.1 前增菌、增菌和分离 5.1.1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按 GB 4789.4 进行。沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录 B。在食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。食物中毒标本不应前增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。5.1.2 志贺氏菌的增菌和分离按GB 4789.5进行。没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT增菌液。食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。5.1.3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。食物中毒标本同时做增菌和不增菌步骤。5.2 噬菌体试验 5.2.1 培养基的准备 营养琼脂平板（含琼脂 1%1.5%，为防止变形杆菌的蔓延生长，可按 0.02%量加入十二烷基硫酸钠），营养琼脂加热溶化后，加入每个 9 cm 平皿中约 20 mL25 mL，放在水平台面上待其凝固。翻转平板，在 36 1 培养箱内半开皿倒置约 1 h，或 50 1 培养箱内半开皿倒置约 30 min，以烘干培养基表面水分。5.2.2 试验菌液的准备 5.2.2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产H2S 或不产 H2S 的菌落，和乳糖阳性产 H2S 的菌落。检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌落。检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种 TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置 36 1 培养 20 h24 h 后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产 H2S，不产气无动力的菌落。下述两种方法可供制备试验菌液时选用。5.2.2.2 方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于 36 1 培养 14 h24 h。挑取此肉汤培养物1 满环（约 5 L），稀释于盛有 1 mL2 mL 的营养肉汤管内，使成为 1:2001:400 稀释菌液，含菌量约为1106 CFU/mL。5.2.2.3 方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有 1mL2 mL 营养肉汤管内，含菌量约为 1106 CFU/mL。5.2.3 涂抹试验菌液 5.2.3.1 斑点涂抹法：将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分，每等分可供涂抹 1 株细菌培养物。每挑取试验菌液 1 满环，涂抹直径约 1 cm 的菌斑一个。每株培养物涂抹菌斑 7 个，外圈 5 个，内圈 2个。5.2.3.2 棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥。5.2.4 滴加噬菌体 用定量为 1 mL 的一次性注射器（针头无编号，1 mL 约有 100200 滴，每滴相当于 5 L10 L），在每一个菌斑上滴加噬菌体。或用定量为 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴，每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同一种噬菌体。滴加的噬菌体依次为 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌体时应将琼脂平板放在水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头。待 7 种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌GB 4789.312013 7 体液干燥。翻转平板，放在 36 培养 5 h6 h，和 14 h24 h 各观察一次结果。如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为 3 mm 的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于 5 L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间。5.2.5 试验结果的判定 必要时（例如不能测定到完整的血清型），可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。噬菌体试验的结果见表 1。表 1 噬菌体试验结果 序号 噬菌体裂解模式 判定结果 O-I C Sh E CE E-4 Ent 1 CL-沙门氏菌属 2 CL-CL-沙门氏菌属(靛基质-),大肠埃希氏菌(靛基质+)3-CL-(-)(-)-弗劳地氏柠檬酸杆菌群a 4-CL v v v-志贺氏菌属b,大肠埃希氏菌 5 CL-CL v v v-大肠埃希氏菌 6 v-CL v v-大肠埃希氏菌 7-CL v-弗劳地氏柠檬酸杆菌群a,大肠埃希氏菌 8-CL-大肠埃希氏菌 9-(-)v-CL 阴沟肠杆菌 0-噬菌体不裂解培养物,用生化试验鉴定 注：CL 表示融合性裂解；表示不裂解；（）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解。a含弗劳地氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、布雷克氏柠檬酸杆菌、沃克曼氏柠檬酸杆菌和吉伦氏柠檬酸杆菌。b按表 3 检索并做血清学分型试验。5.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法 采用如下 3 种噬菌体：沙门氏菌 O-I 噬菌体；E 多价噬菌体，内含 E 和 Sh；C 多价噬菌体，内含 C、CE 和 Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为 4 等分或 6 等分，每等分可供涂抹一株细菌培养物，每株培养物涂抹 3 个菌斑，外圈 2 个，内圈 1 个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹 5 条菌带，置数分钟，待菌斑干燥。依次滴加上述 3 种噬菌体。斑点涂抹法，一般可把 O-I 噬菌体滴加在内圈的菌斑上。带状涂抹法，可将 O-I 噬菌体滴加在菌带的左边。待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在 36 培养 5 h 6 h，和 14 h 24 h 各观察一次结果。按表 2 判定结果。表 2 噬菌体试验简化诊断法 O-I E 多价 C 多价 判定结果 CL-沙门氏菌属 v CL v 大肠埃希氏菌-CL 弗劳地氏柠檬酸杆菌群a-噬菌体不裂解培养物 注：CL 表示融合性裂解；表示不裂解；v 表示裂解或不裂解。a除表 1 的注中所述外，并含阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。GB 4789.312013 8 5.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验 少数沙门氏菌培养物不被 O-I 噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，按 GB 4789.4 做 5 项生化试验，血清学分型鉴定后判定结果。5.4 血清学分型鉴定及其他补充试验 5.4.1 沙门氏菌分型鉴定 按 GB 4789.4 进行。如果判定为沙门氏菌时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定 5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。分离的菌株应该同时被同样的几个噬菌体裂解后，用大肠埃希氏菌分型噬菌体试验，这些菌株应该具有相同的裂解模式，同时测