GBT 13267-1991 水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法.pdf

中华人民共和国国家标准水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法 Wa t e r q n e t 训 y 一加加 r s n 枷址扬.成 t h ea c u t e t o x i c i t y o f s u b s t a n c e t o a f r e s h w a t e r f i s h (B r a c h y d a n i o r e r i o H a mi l t o n-B u c h a n a n)G B/T 1 3 2 6 7 一9 1 本标准参照采用国际标准I S O 7 3 4 6 3-3 f(水质 物质对淡水鱼(斑马 鱼 I i r a c h y d a n i o 二。o)急性致死毒性的测定),本标准可根据被测物质的性质确定采用静水式、换水式或流水式试验。推荐采用斑马鱼井不排除使用其他鱼种，但对试验条件需做相应的改变,例如稀释水性质及温度。除 斑马鱼(B r a c h y d a n i o r e r i o)外，在不改变本标准的试验条件下，青娥鱼(O r y z i a s l a t i p e s)(真骨鱼总目 青娜科)亦可供使用。本标准使用重铬酸钾(K,C r,4,)为参考毒物。在2 4 h 试验期间重铭酸钾的L C 5 0 值必须处于2 0。一4 0 0 m g/L 之间。飞 主题内容与适用范阻 本标准规定了在确定的试验条件下测定水溶性物质引起斑马鱼急性致死毒性大致范围的方法静水法、换水法和流水法口 本标准适用于水中单一化学物质的毒性测定。工业废水的毒性测定也可使用此方法。(废水样品的采集、保存、干扰的处理见附录A,)2 原理 在确定的 试验条件下用斑马鱼为试验生物测定毒物在4 8 h 或9 6 h 后引起受试斑马鱼群体中5。%鱼 致死的 浓度。这个浓度以2 4 h,4 8 h,7 2 h 或9 6 h L C 5 0 表示。3 定义3,1 静水式试验 试验期间不需更换试验液，限于研究那些化学性质比 较稳定的物质。32 换水式试验 每2 4 h 或更 短的时间内更新一次试验液。可用于试验这类物质。它们的浓度在更换试验液的时间内 相对稳定(亦即波动在初始 值的2 0 Y,之内)。3.3 流水式试验 试验液连续更新;可用于大多数物质，包括水中不稳定的物质。Q 试验生物和试验溶液的制备4.1 试验生物国家环境保护局，9 9 1-0 9 一 1 4 批准1 9 9 2 一 0 8 一 0 1 实施G B/r 1 3 2 6 7 一 9 1 试验鱼 种应 是 斑马 担 尼 鱼(真 骨 鱼总目，鲤 科)(B r a c h y d a n io r e r io H a m il t o n-B u c h a n a n(T e le o s t e iC y p r i n i d a e)3。试验鱼体长3 0 15 m m，体重。.3 士。.1 g,选自 同一驯养池中规格大小一致的幼鱼。试验前该鱼群应在与试验时相同的环境条件下，在连续曝气的水中至少驯养两周。试验前2 4 h 停止喂饲，每天清除粪便及食物残渣。驯养期间死亡率不得超过1 o 0/n，如果超过1 0%，则该批鱼不得用作试验 试验鱼应无明显的疾病和肉眼可见的畸形。试验前两周内不应对其做疾病处理。斑马鱼驯养、繁殖的环境参数见附录B4.2 标准稀释水 新配制的标准稀释水p H为7.8 士。.2，硬度为2 5 0 m g/L左右(以C a C O。计)，用蒸馏水或去离子水由下面4 种溶液制备。a.氯化钙溶液 将1 1.7 6 g 氯化钙(C a C l,，2 H,O)溶于水中并稀释至1 L.b.硫酸镁溶液 将4.9 3 g 硫酸镁(M g S O,7 H O)溶于水中并稀释至1 L,c.碳酸氢钠溶液 将2.5 9 g 碳酸氢钠(N a H C O,)溶于水中并稀释至1 L,d氯化钾溶液 将0.2 3 g 氯化钾(K C l)溶于水中并稀释至1 L,将以上四种溶液各取2 5 m L加以混合并用蒸馏水稀释至1 L。将制备好的稀释水曝气至溶解氧浓度达到空 气饱和值(A S V)，并将p H稳定在7.8 士。2。如果需要，用氢氧化钠溶液或盐酸调节p H，这样制备的稀释水试验前不需强制曝气。4.3 制备试验物质储备液 配制试验物质储备液所用试剂至少为分析纯。将已 知量的试验物质溶于一定体积稀释水、去离子水或蒸馏水中。储备液应当天配制。对于化学性质较稳定的物质，可配制供两天以上使用的溶液，配好后低温保存。溶解低溶解度的物质时，可使用超声波装置，也可加入对鱼低毒的有机溶剂。有机溶剂在试验溶液中的浓度不应超过。.1 m g/L。并应同时进行两组对照试验，一组含有的溶剂为全部试验溶液中的最高浓度，另一组则不含溶剂或试验物质。4.4 试验溶液的配制及浓度的选择 向稀释水中加人适当的试验物质储备液，使达到所需要的浓度。配制试验溶液时，按几何级数间距选择浓度。如8,4,2,1,0.5 等。在测定废水样品时，可以百分比体积浓度按几何级数间距选择浓度。5 仪器设备 试验容器用玻璃或其他化学惰性物质制成，应不明显吸附试验物质。常用设备、尼龙或其他软惰性材料制成的抄网，应专网专用。5.1 试验容器 静水式、换水式试验所用的容器应有足够大的容积，水量一般以鱼的负荷1 克鱼/升水计算。试验介质与空气间有足够大的界面(每I O L介质要有大约8 0 0 c。的介面积).并备有牢固的密封盖。流水式试验的容器，可用多颈的圆底玻璃烧瓶(容积2 L)，带有磨口的玻璃接口(见图1)，或用类似的玻璃仪器使用多颈圆底烧瓶时，一个颈上安有标准进口 管，第二个安出口 管的颈上应装一个粗孔过滤器。初次使用的试验容器用前应仔细清洗。试验后.倒空容器，以适当的手段清洗，用水冲去痕量试验物质及清洗剂，干燥后备用。试验容器临用前用稀释水冲洗。c s/T 1 3 2 6 7 一 9 1一s 图 1 流水法所用仪器举例 1-磨口 玻璃接口沼 一试验液入口;3 一试验液出口;4 一磨口 玻璃接口;5 一 粗孔过滤;6-塑料支择环5.2 控温设备 用适宜的方法将试验溶液和蓄养池中的水温调节在2 3 士1 C,6 试验亲件6.，采用标准稀释水为试验用水。试验溶液的配备与储存、鱼的管理及全部操作和试验都应在空气污染物未达到有害浓度的大气中进行。6.2 为避免对试验鱼不必要的扰动，试验液中溶解氧不少于4 m g/L。每天光照保持1 2 -1 6 h。试验期间水温恒定在2 3 士1 0C。试验前2 4 h 停止给试验鱼喂食，整个试验期间亦不喂食。6.3 可酌情选择纯化学化合物如重铬酸钾为参考毒物。可根据需要进行多次参考毒物的毒性试验，以得到参考毒物试验数据重现性的资料。每当蓄养种群发生变化都应按本方法规定的条件重复进行试验这些试验结果应与同一实验室早先测得的结果一致。7.1试验步骤 预备试验7.1.1 预备试验用于确定试验浓度的大致范围。这一范围一般可以以1 0 为公比 做间隔。例如:1 0 0 0,1 0 0,1 0,1 和0.1 m g/L o 向六个容器中均加入标准稀释水(4.2)，如果需要，进行曝气使溶解氧浓度恢复到空气饱和值。向其中五个容器中 加入适量的试验物质储备液(4.3)，配制一组适宜的浓度系列，第六个容器用做对照。如果数据不充分，无法确定正式试验所需要的浓度范围，则另选一个浓度范围进行试验。7.1.2 将溶液在2 3 f1 恒温。试验时间为2 4 4 5 h。向每个容器放五尾鱼，每天至少记录两次每个容G B/r 1 3 2 6 7 一 9 1器中的死鱼数目及溶解氧浓度，并及时将死鱼取出。7.1.3 如果采用流水式试验.则应用流水法做预备试验。7.1.4 测定废水样品时，应当首先测定废水样品的溶解氧含量并了解废水的大致性质。只有废水含有适量的溶解氧时，才能不经稀释进行毒性试验。了.2 正式试验7.2.1 从2 4 h 预备试验中杀死全部鱼的最低浓度与未毒死鱼的最高浓度之间，以几何级数做间距，至少选择5 个浓度为正式实验的浓度。其浓度范围在三个依次的几何系列浓度中最好能够测得2 0%到8 0%的死亡率以估计L C 5 0 值。7.2.2 至少取6 个容器(流水式试验用6 个2 L的烧瓶与辅助设备连好)，均加入标准稀释水。其中一个为空白试验即对照试验，其余容器中加入不同量的储备溶液，以得到所要求的浓度范围。如果用有机溶剂溶解物质，则需配制第二个“对照”溶液，使标准稀释水中有机溶剂的浓度与试验液中有机溶剂的最高浓度相当。将试验液温度恒定在 2 3 士1 0C，按下述方法向每个容器中放入 1 0 尾或更多的试验鱼。用尼龙或其他软惰性材料编织的小孔抄网从驯养鱼群中随机选取鱼放人试验容器中。取要迅速，在鱼转移过程中因操作不慎掉下的鱼或其他操作不善的鱼弃去不用。所有的鱼需在3 0 m i n内 转移完毕。7.2.3 使用换水式试验时，8-2 4 h 更新一次试验液(视试验物质的性质、溶解氧等具体情况而定)，立即将试验鱼转移到其中去。转移时从最低浓度开始依次向高浓度过渡，避免因使用抄网造成的各容器间试验物质的明显转移。7.2.4 流水式试验时，启动流水装置，更新溶液的速率至少为2 5 L/d。如果出口 溶液的溶解氧浓度能维持大于6 0 0 o A S V，则更新速率可以低到1 2 L/d。可连续更新，也可在短时间内间歇更新。用于更新的试液的温度需控制在2 3 士I C。鱼转移的方法同7.2.2,7.2.5 随时观察并记录试验鱼的平衡、游动、呼吸、体色变化等中 毒症状。试验开始后3-6 h 内要特别注意观察。每天至少记录两次每个容器中的死鱼数目(用玻璃棒轻触鱼的尾部，没有反应即认为已死亡)，及时清出死鱼。对照组的死亡率不得超过1 0 0 o，对照组试验期间鱼的外表及行为不正常或病态鱼也不得超过1 0 0 0，否则要重新进行试验。试验开始和试验结束时测定试验液及储备液中被测物质的浓度。每天至少测定一次各试验液的溶解氧,p H和温度。试验开始和结束时亦要测定。斑马鱼急性毒性观察记录表格见附录C,8 结果的表述8.1 直线内 插法估算L C 5 0 用简单的图 示法估算L C 5 0 时，可绘制死亡百分率对试验物质浓度的曲线。采用线性刻度的坐标轴时是一条S 形的 关系曲 线，从引 起5 0%死亡率的内 插浓度值得到L C 5 0 值(见图2)0二 _-0趁/!r尸 _/W,-一二 2霎】/:L C 5 0=2.3 m g/L !/:0.5 2 a B浓度，口g/L图 2 直线内插法估算L C 5 08.2 概率单位图解法估算L C 5 0G s/r 1 3 2 6 7 一 9 1 将试验浓度下观察到的鱼的死亡数列表。要计算2 4,4 8,7 2 和9 6 h L C 5 o 值。但一般以4 8 h L C 5 0 或9 6 h L C 5。表示结果。以浓度对数作为横坐标，死亡概率为纵坐标，在算术坐标纸上绘图。百分率与概率单位换算表见附录D。由于概率单位尺度达不到。和1 0 0，作图时，若是需要这样的数值，可使用箭头以表示这些点的真正位置。其次，用目 测法画一条直线，使它拟合图中的数据点。要特别考虑1 6%和8 4%死亡率之间的数据点，即:死亡概率4 和6 之间的点。力求减少这些点与直线间垂直偏离的总和，如果无法确定如何安排这条直线，可以尽量将它画向水平方向。因为这样便承认了数据中较大的变异性。从定出的直线读出致死5 0 0 0的浓度对数，从而估算出L C 5 0。例如:图2 中的浓度及百分死亡率可换算成如下数后，在算术坐标上绘图(见图3),浓度浓度对数死亡百分比死亡概率0.5 p p.一 0.3 001 p p.01 0%3.722 p p.0.3 04 0%4.7 54 p p-0.6 09 0%6.2 88 p p m0.9 01 0 0%(6 4%)(5 0%)5铃靡泪陈(1 6%)(2.3 mg/L)一0。3 00.加0.3 6 0.6 0一0.9 0浓度对数图 3 概率单位