GB 4789.39-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 粪大肠菌群计数.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB 4789.392013食品安全国家标准食品微生物学检验 粪大肠菌群计数2013-11-29 发布2014-06-01 实施GB 4789.392013I前言本标准代替GB/T 4789.39-2008食品卫生微生物学检验 粪大肠菌群计数。本标准与GB/T 4789.39-2008相比，主要修改如下：修改了标准的中文名称；修改了操作步骤；增加了附录B。GB 4789.3920131食品安全国家标准食品微生物学检验 粪大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中粪大肠菌群计数的方法。本标准适用于各类食品中粪大肠菌群的计数。2术语和定义2.1粪大肠菌群一群在44.5 培养24 h48 h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群来自人和温血动物粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。3技术要求设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36 1;b)冰箱：2 5;c)恒温水浴箱：44.5 0.2;d)天平：感量 0.1 g;e)均质器;f)振荡器;g)无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头;h)无菌锥形瓶：容量 500 mL;i)无菌培养皿：直径 90 mm;j)pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。4培养基及试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。4.2EC 肉汤（E.coli Broth）：见附录 A 中 A.2。4.3无菌生理盐水：见附录 A 中 A.3。4.41 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.4。4.51 mol/L HCl：见附录 A 中 A.5。5检验程序粪大肠菌群检验程序见图1。GB 4789.3920132图 1粪大肠菌群 MPN 计数法检验程序6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品，置盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min10 000 r/min 均质 1 min2 min，制成 1:10 样品匀液，或置 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打 1 min2 min，制成 1:10 的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取样品 25 mL 置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。6.1.3样品匀液的 pH 值应在 6.57.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。6.1.4用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入盛有 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。6.2初发酵试验检 样25g(mL)样品+225mL 稀释液，均质10 倍系列稀释月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤36148h2h不产气产气EC 肉汤44.50.224h2h不产气产气粪大肠菌群阴性管粪大肠菌群阳性管查 MPN 表报告结果GB 4789.3920133每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 1培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2h。记录在24 h和48 h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。如采用多个稀释度，最终确定最适的三个连续稀释度方法参见附录B。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于预先升温至44.5 的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放入带盖的44.5 0.2 恒温水浴箱内，培养24 h2 h，水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面，记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。定期以已知为44.5 产气阳性的大肠杆菌和44.5 不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.4粪大肠菌群 MPN 计数的报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表（见附录C），报告每g(mL)粪大肠菌群的MPN值。GB 4789.3920134附录 A培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g氯化钠5.0 g乳糖5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g月桂基硫酸钠0.1 g蒸馏水1 000.0 mLA.1.2制法将A.1.1 成分溶解于蒸馏水中，校正pH至6.80.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL，121 高压灭菌15 min。A.2EC肉汤（E.coli Broth）A.2.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g3号胆盐或混合胆盐1.5 g乳糖5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0 g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5 g氯化钠5.0 g蒸馏水1 000.0 mLA.2.2制法将 A.2.1 成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 至 6.90.1。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 8 mL，121高压灭菌 15 min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5 g蒸馏水1 000.0 mLA.3.2制法GB 4789.3920135称取 8.5 g 氯化钠溶于 1000 mL 蒸馏水中，121 高压灭菌 15 min。A.41 mol/L NaOHA.4.1成分NaOH40.0 g蒸馏水1 000.0 mLA.4.2制法称取40g 氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中。A.51 mol/L HClA.5.1成分盐酸90.0 mL蒸馏水1 000.0 mLA.5.2制法移取盐酸 90 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL。GB 4789.3920136附录 B确定最适的三个连续稀释度方法在10-110-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度（见表B.1示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同）；在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见表B.1示例c）；如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例d）；如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表B.1示例e）;b）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度（见表B.1示例f）；如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例g）。MPN计算阳性结果的选择示例见表B.1。表 B.1关于 MPN 计算阳性结果的选择示例示例编号接种样品量mL选择的三个连续稀释度阳性管数MPN/g(mL)0.1g0.01 g0.001 g0.0001 g0.00001 ga331003-1-0430b231003-1-0430c322102-2-1280d322012-2-1280e333323-3-2110000f001000-0-13g221102-2-235注：下划线表示应选择的连续稀释度。GB 4789.3920137附录 C粪大肠菌群最可能数（MPN）表每g(mL)检样中粪大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表C.1。表C.1粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%置信区间阳性管数MPN95%置信区间0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限0001100420注 1：本表采用 3 个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和 0.001g(mL)、每个稀释度接种 3 管。注 2：表内所列检样量如改用 lg（mL）、0.1g(mL)和 0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高 10 倍，其余类推。