GB 19171-2003 双孢蘑菇菌种.pdf

GB 1 9 1 7 1-2 0 0 3前言本标准的附录 A、附录 B均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:福建省轻工业研究所、福建省蘑菇菌种研究推广站。本标准主要起草人:王泽生、廖剑华、曾辉、陈军、陈美元。GB 1 91 7 1-2 0 0 3引言 栽培双抱落菇使用的菌种是人工培育的纯菌丝体及其培养基的混合体。我国采用三级扩大繁育程序(即 母种、原种、栽培种)培育双抱蘑菇菌种。为了规范我国双抱蘑菇菌种生产、经销和使用，确保我国双抱蘑菇生产持续健康发展，特制定本标准。CB 1 9 1 71-2 0 0 3双 抱 蘑 菇 菌 种1 范围 本标准规定了 双抱蘑菇(A g a r i c u s装、贮运等。本标准适用于双抱蘑菇(A g a r i c u sb i s p o r u s)菌种的质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包b i s p o r u s)菌种的生产、经销和使用。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 1 9 1 包装储运图示标志(G B/T 1 9 1-2 0 0 0,e g v I S O 7 8 0;1 9 9 7)G B/T 4 7 8 9.2 8 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 G B/T 1 2 7 2 8-1 9 9 1 食用菌术语 G B 1 9 1 7 2-2 0 0 3 平菇菌种 N Y/T 5 2 8-2 0 0 2 食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 母种s t o c k c u l t u re 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管为培养容器和使用单位，也称一级种、试管种。N Y/T 5 2 8-2 0 0 2，定义3.3 13.2 原种 p r e-c u l t u re s p a w n 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶或1 5 c m X 2 8 c m聚丙烯塑料袋为容器。N Y/T 5 2 8-2 0 0 2，定义3.4 3.3 栽培种 s p a w n 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以玻璃瓶或塑料袋为容器。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。N Y/T 5 2 8-2 0 0 2，定义3.5 3.4 领顽现象 a n t a g o n i s m 具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线行边缘的现象。G B 1 9 1 7 2-2 0 0 3，定义3.4 3.5 角变s e c t o r IG日 1 9 1 71-2 0 0 3 因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。G B 1 9 1 7 2-2 0 0 3，定义3.5 13.6 高温抑制级h i g h t e m p e r a t u re d l i n e 食用菌菌种在生产过程中受高温的不良影响，培养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的现象。G B 1 9 1 7 2-2 0 0 3，定义3.6 13.7 同工阵 i s o e n z y m e 催化相同生化反应，而结构及理化性质不同的酶分子。通过凝胶电泳使同工酶分离成迁移率不同的区带，经生物化学染色后显示出的同工酶谱，可对生物品种进行酶分子水平的鉴别或鉴定。3.8 生物学效率 b i o l o g i c a l e f f i c i e n c y 单位数量培养料的干物质与所培养产生出的子实体或菌丝体干重之间的比率。G B/T 1 2 7 2 8-1 9 9 1，定义 2.1.2 0 3.9 种性c h a r a c t e r s o f v a r i e t y 食用菌的品种特性是鉴别食用菌菌种或品种优劣的重要标准之一。一般包括对温度、湿度、酸碱度、光线和氧气的要求，抗逆性、丰产性、出菇迟早、出菇潮数、栽培周期、商品质量及栽培习性等农艺性状。N Y/T 5 2 8-2 0 0 2，定义3.8 4 质量要求4.1 母种4.1.1 容器规格应符合 N Y/T 5 2 8-2 0 0 2中4.7.1.1 规定。4.1.2 感官要求应符合表1 规定。表 1 母种感官要求项目要求容器完整，无损棉塞或无棉塑料盖干操、洁净，松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基滋人i t为试管总容积的四分之一至五分之一培养基斜面长度顶端距棉塞4 0 m m-5 0 m m接种量(接种块大小)(3-5)mmX(3-5)mm菌种外观菌丝生长量长满斜面菌丝体特征洁白或米白、浓密、羽毛状或叶脉状菌丝体表面均匀、平整、无角变菌丝分泌物无菌落边缘整齐杂菌菌落无斜面背面外观培养基不干缩，颇色均匀、无暗斑、无色素气味有双泡曹菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味GB 1 91 71-2 0 0 34.1.3 微生物学要求应符合表 2 规定。表 2 母种徽生物学要求项 目要求菌丝粗壮杂菌无4.1.4 菌丝生长速度:在 P D A培养基上，在适温(2 4 士1 0C)下，1 5 天2 0 天长满斜面。4.1.5 母种遗传和栽培性状:供种单位需对所供母种进行醋酶(E s t)同工酶类型鉴定，确认其遗传类型与对照相同后，再经出菇试验确证农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁殖或出售。4.1.5.1 菌丝体 E s t 同工酶的板状聚丙烯酞胺凝胶电泳类型:包括 G型(呈现 e l,e 3特征带),H型(呈现 e 2,e 4 和e 3 0-e 3 3 特征带)、H G 1-H G 2 型(呈现 e l,e 3,e 3 0-e 3 3 特征带)和 H G 4型(呈现 e l,e 2,e 3,e 4 和e 3 0-e 3 3 特征带)等。以E s t 区带向正极泳动距离与澳酚蓝指示剂向正极泳动距离的比值作为电泳相对迁移率(R.).e l,e 2,e 3,e 4,e 3 0,e 3 1,e 3 2和 e 3 3的 R m值分别为 0.8 2 0,0.8 1 0,0.7 6 0,0.7 5 0,0.1 2 8,0.1 0 0,0.0 7 0和 0.0 1 0,4.1.5.2 菌丝萌发、定植与生长能力:接种到适合的培养基后，在正常条件下 2 4 h内萌发，定植迅速、菌丝健壮。4.1.5.3 结菇转潮能力:覆土后 1 2天1 6天结菇，分布均匀;1 8天2 2天采菇，每潮菇间隔7 天一1 0 天。4.1.5.4 生物学效率:在正常条件下生物学效率不低于3 0 a,4.2 原种4.2.1 容器规格应符合N Y/T 5 2 8-2 0 0 2 中4.7.1.2 规定。4.2.2 感官要求应符合表3 规定。表 3 原种感官要求项目要求容器完整，无损棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净，松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基上表面距瓶口的距离5 0 mm士5 mm接种量(每支母种接原种数，接种物大小)(4 -6)瓶(袋),)1 2-.X 1 5 m m菌种外观菌丝生长量长满容器菌丝体特征洁白浓密、生长旺健表面菌丝体生长均匀，无角变，无高温抑制线培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁，无干缩表面分泌物无杂菌菌落无靓顽现象无气味有双泡蘑菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味4.2.3 微生物学指标应符合表 2 规定。4.2.4 菌丝生长速度:在适宜培养基上，在适温(2 4 士1 C)下菌丝长满容器不超过 4 5 天。4.3 栽培种4.3.1 容器规格应符合N Y/T 5 2 8-2 0 0 2中4.7.1.3 规定。GB 1 9 1 7 1-2 0 0 34.3.2 感官要求应符合表4 规定。表 4 栽培种感官要求项目要求容器完整，无损棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净，松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基面距瓶(袋)口的距离5 0-士5 mm接种量仁 每瓶(袋)原种接栽培种数习(3 0-5 0)瓶(袋)菌种外观菌丝生长量长满容器菌丝体特征洁白浓密、生长旺健不同部位菌丝体生长均匀，无角变，无高温抑制线培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁，无干缩表面分泌物无杂菌菌落无颇顽现象无气味有双抱蘑菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味4.3.34.3.4微生物学指标应符合表 2 规定。菌丝生长速度:在适宜培养基上，在适温(2 4 士1 0C)下菌丝长满瓶(袋)不超过4 5 天。5 抽样5.1 质检部门的抽样应具有代表性。5.2 母种按品种、培养条件、接种时间分批编号，原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。5.3 母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的1 0 0/a,5%,1 0/a。但每批抽样数量不得少于1 0 支(瓶、袋);超过 1 0 0 支(瓶、袋)的，可进行两级抽样。6 试验方法6.1 感官检验 按表 5 逐项进行。表 5 感官检验方法检验项 目检验方法检 验 项 目检验方法容器肉眼观察接种量母种、原种肉眼观察栽培种检查生产记录棉塞、无棉塑料盖肉眼观察一 丝 生 长 肉眼观察母种培养基灌人量肉眼观察 菌 种 夕 卜 观 各 项 杂 菌 菌 落 除 外，肉眼观察母种斜面长度肉眼观察一 杂菌菌肉眼观察，必要时用 5 X放大镜观察母种斜面正面外观各项肉眼观察培养基上表面距瓶 (袋)口的距离肉眼观察1鼻嗅GB 1 9 1 71 一 2 0 0 362 微生物学检验6.21 表2中菌丝和杂菌用放大倍数不低于10 x40 的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于50 个视野。6.22 细菌检验:取少量疑有细菌污染的培养物，按无菌操作接种于G B/T4 7 8 9.2 8中4.8 规定的营养肉汤培养液中，25一28振荡培养 1 天一2 天，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染;培养液澄清，为无细菌污染。6.2.3 霉菌检验:取少量疑有霉菌污染的培养物，按无菌操作接种于 P D A培养基(见附录 A)中，2528培养3 天4 天，出现双抱蘑菇菌落以外的菌落，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。6.3 菌丝生长速度6.3.1 母种:P D A培养基，在24士1 下培养，计算长满需天数。6.3.2 原种和栽培种:采用第B.1 章或第B.2 章规定的配方之一，在24士1 下培养，计算长满需天数。6.4 母种遗传和栽培性状6.4.1 菌丝体 E st同工酶的板状聚丙烯酞胺凝胶电泳:取菌龄为 15天20 天的试管母种，刮取菌丝，按1:3:。.5 的比 例混合菌丝(9)、0.l m ol/L 磷酸缓冲液(m L)和石英砂(9)，研磨成匀浆，台式离心机1000o r/m i n 离心s m in，取上清液，按5:1:1 的比 例混合上清液、40%蔗糖和。.01%嗅酚蓝溶液作为电泳样品，4 下冷藏备用。采用聚丙烯酞胺凝胶电泳。用p H S.g T ri s 一 H CI缓冲液配制9 肠分离胶，用p H S.3 T r i s 一 甘氨酸作电极缓冲液。点样7 5 严 L，3 下1 2 o V电泳Z o m i n 后稳压Z O O V，4 h。用固蓝R R盐6 o m g，0.l m o l/L磷酸缓冲液(p H 6.0)s o m L，a 一 禁乙酷3 8 m g 和民 蔡乙醋3 8 m g 溶于3 m L 丙酮配制的染色液，染色，显现酶谱，再根据特征带分型。6.42 栽培性状:使用附录B中B.2.1 培养基按表6 各项观察记录。6.4.2.1 菌丝萌发、定植与生长能力:接种到附录B中B.2.1 培养基(含水量提高到68%)上，在适温(24 士1)下培养，肉眼观察菌丝萌发、定植与生长情况。6.4.2.2 结菇转潮能力:栽培试验，肉眼观察，计算覆土到出第一潮菇的时间。6.4.2.3 生物学效率:栽培试验，记录、统