GBT 18085-2000 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法.pdf

I C S 6 5.0 2 0B 1 6暑黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 8 0 8 5-2 0 0 0 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d s f o r i n s p e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f T i l l e t i a c o n t r o v e r s a Ki i h n2 0 0 0 一 0 4 一 2 6 发布2 0 0 0 一 1 0 一 0 1 实施国 家 质 量 技 术 货 督 局发布Gs/T 1 8 0 8 5-2 0 0 0前言 小麦矮化腥黑穗病菌(T i l l e t i a c o n t r o v e r s a K o h n)是我国进境植物检疫危险性病害。为了防止该植物病原菌随小麦、大麦、黑麦和其他寄主植物种子传入我国，在进境植物检疫时，需正确掌握小麦矮化腥黑穗病菌的检疫和鉴定方法。本标准在制定过程中，总结了多年植物检疫的实践经验，吸收了国际和国内的最新研究成果，根据小麦矮化腥黑穗病菌的形态学特征、自 发荧光显微学特征和萌发生理学特征，确定了检疫和鉴定小麦矮化腥黑穗病菌的各项技术要求。本标准的附录 A是标准的附录。本标准由农业部提出。本标准负责起草单位:中 华人民共和国大连出 入境检验检疫局。本标准参加起草单位:中华人民共和国国家出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准起草人:彭金火、章正、周国梁、毛志农、黄冠胜。中华 人 民 共和 国国 家 标 准 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB/T 1 8 0 8 5-2 0 0 0P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d s f o r i n s p e c t io n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f T i l l e t i a c o n t r o v e r s a K II h n范 围本标准规定了进境植物检疫中小麦矮化腥黑穗病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进 口小麦、大麦和黑麦中小麦矮化腥黑穗病菌的检疫和鉴定。:.定义 本标准采用下列定义。样品 s a m p l e1 原始样品 o r i g i n a l s a m p l e在现场各点扦取的样品。每份原始样品的质量应不少于5 0 g o.2 复合样品 c o m p o s i t e s a m p l e未经充分混匀的 原始样品的总和。每份复合样品的质量应不少于1 5 0 0 g,.3 平均样品 a v e r a g e s a m p l e复合样品经充分混合均匀后的样品。.4 试验样品 t e s t s a m p l e从平均样品中 称取的、用于洗涤离心的样品。每份试验样品的质量为5 0 g,.5 保存样品 k e e p s a m p l e取走试验祥品后用来保存以备复检和仲裁的 剩余平均样品。保存样品的质量应不少于1 0 0 0 g o 网 脊高度值 r e t i c u l u m h e i g h t冬抱子外胞壁的垂直高度值，在光学显微镜下表现为冬抱子外胞壁的刺状或齿状突起的垂直高度临界网 脊高度指数值 t h r e s h o l d o f r e t i c u l u m h e i g h t用来确定单个冬抱子属性的网脊高度值，其数值为。.9 5 u m,门ZaC口2.值2.原理 小麦矮化腥黑穗病菌是危害麦类作物的一种担子菌，属担子菌亚门(B a s i d i o m y c o t in a)，冬抱菌纲(T e l io m y c e t e s)，黑粉菌目(U s t i l a g i n a l e s),腥黑粉菌科(T i l l e t i a c e a e),腥黑粉菌属(T i l l e t i a)。病原菌在麦类作物苗期形成系统侵染。被侵染作物结实时，籽粒被病菌的繁殖体冬抱子侵占，成为菌奥。该病原菌的 冬抱子形态学特征、自 发荧光显微学特征和萌发生理学特征与其他腥黑粉病菌不同，是鉴定 该病原菌的依据。3 门冬抱子形态特征国家质f技术监督局2 0 0 0 一 0 4 一 2 6 批准2 0 0 0 门0 一 0 1 实施 tGa/T 1 8 0 8 5-2 0 0 03.1.，冬抱子 小麦矮化腥黑穗病菌的冬抱子星球形、椭圆形或不规则形，具网状饰纹和无色到淡色的胶质鞘，直径(含胶质鞘)为 1 6.8 0 jA m-3 2.1 9 t m，通常为 1 8 p m-2 4 p m;冬抱子萌发适宜温度为 2 C-8 C，萌发时形成先菌丝(担子)，在其顶端产生初生小 抱子(担抱子)，初生小抱子经“H”形交配后产生新月 形次生小饱子。3.1.2 网 脊高度值 该特征是小麦矮化腥黑穗病菌和其近似种 小麦网腥黑穗病菌(T i l l e t i a c a ri e s T u l.)冬抱子最重要的区别特征，前者的网脊高度值(平均值士标准差)为 1.4 3 F a m士。.1 4 JA M，后者为。.5 3 p m士0.1 9 tc m.3.1.3 临界网脊高度指数值 当某个冬抱子的网脊高度值大于。.9 5 l c m时，视为小麦矮化腥黑穗病菌冬抱子，小于或等于0.9 5 K m 时，视为小麦网腥黑穗 病菌冬抱子。32 冬抱子自发荧光显微学特征 在激发滤光片4 8 5 n m、屏障滤光片5 2 0 n m的激发下，小麦矮化腥黑穗病菌冬 抱子在3 m i n 内可产生自发荧光，其近似种小麦网腥黑稿病菌则不具备该能力。3.3 冬抱子萌发 小麦矮化腥黑穗病菌冬抱子在5 萌发、1 7 不能萌发，而小麦网 腥黑穗病菌冬泡子在5 和1 7 0C均可萌发。4 仪器设备4.1 万能显微镜:具落射汞灯装置、摄像转换器及监视器。4.2 滤光片组:4 5 0 4 9 0 n m激发，5 2 0 n m屏障。4.3 目镜和镜台测微尺。4.4 往复式震荡器。45 低速离心机。4.6 干热灭菌器。4.7 高压灭菌器。4.8 普通天平:感量1/1 0 0,4.9 超净工作台。4.1 0 生物培养箱:具光照，低温可调至5,C。4.1 1 可调微量加样器:5 li L 2 0 0 p L.4.1 2 三角烧瓶:2 5 0 mL.4.1 3 刻度离心 管:1 0 m L或2 0 m L,4.1 4 培养皿:直径9 c m.4.1 5 载玻片:长X 宽为2 5.4 m m X 7 6.2 m m，厚0.8 m m.4.1 6 盖玻片:1 8 m m X 1 8 m m.4.1 7 孔筛:长孔筛直径2 0 c m，孔径1.7 m mX 2 0 m m;圆孔筛直径2 0 c m，孔径2.5 m m.4.1 8 P a r a f i l m膜或铝铂纸口5 药 品 除非另作说明，以下药品的纯度均为化学纯。5.1 次氯酸钠溶液或漂白粉精片。5.2 吐温-2 0(T w e e n-2 0)eGs/T 1 8 0 8 5-2 0 0 05.3 席尔氏浮载剂，也可由下述药品配制(见附录 A),5.3.1 乙酸钾(C H3 0 00 K).5.3.2 甘油 C H3(OH)C H(O H)C H3(O H)D.5.3.3 乙醇(C 2 H,O H).5.3.4 柠檬酸(C,Ha O),5.3.5 甲醇(C H30H).5.3.6 磷酸氢二钠(N a 2 H P 0,).54 青霉素、链霉素(医用注射粉剂)。5.5 琼脂粉。5.6 无荧光显微镜物镜镜头油(N d=1.5 1 6),5.7 永久封片剂。现场检 疫6.1 船运散装货物的原始样品的扦取和复合样品的制备 船运散装小麦、大麦、黑麦和其他小麦矮化腥黑穗病菌的寄主植物籽粒分舱别、分层次、分品种、分等级按棋盘式选 3 0点5 0 点扦取原始样品并制成复合样品。必要时，取样点可增至 9 0 个，复合样品的质量可增至4 5 0 0 g。使用一次性塑料袋盛放样品。以其他方式进口的小麦、大麦、黑麦和其他小麦矮化腥黑穗病菌的寄主植物籽粒(含种质资源)以车、车皮或其包装为单位，扦取 1 份复合样品。其余按照本标准执行。6.1.，第一次取样 卸货前在表层进行。6.1.2 卸货期间取样 每1 0 0 0 t 货物扦取、制备一份复合样品。6.1.3 样品登记 扦取的样品必须登记。登记项目包括船名、发货港、原产地、品种及等级、舱别和层次、扦样时间、样品编号、扦样员姓名等。6.2 菌瘦检查 在虫害和杂草检验时同时进行。62.，获取筛下物 在扦取原始样品的同时，每点至少另取2 0 0 0 g 样品至孔筛进行筛检。每筛旋转(1 0 2 0)次，弃筛上物，留筛下物。6.2.2 挑取菌瘦 仔细检查筛下物中有无可疑菌瘦碎块。如有，编号装管，带回实验室制片镜检。必要时，将筛下物携回实验室作进一步检查。实验室检验7.1 制备平均样品 在样品预处理室内 将按6.1 条获取的各个复合样品 在原扦样袋中分别充 分混匀，制成平均样品。7.2 样品检验7.2.1 称样 从按 7.1 条制成的各平均样品中称取5 0 g 作为试验样品。7.2.2 洗涤和离心。7.2.2.1 加水GB/T 1 8 0 8 5-2 0 0 0 将试验样品倒入经干热灭菌(1 6 5 C,1.5 h)后的2 5 0 m L 三角烧瓶内，加蒸馏水1 0 0 m L，再加表面活性剂吐温-2 0 1-2 滴。7.2.2.2 封 口 用铝铂纸或 P a r a f i l m膜将三角烧瓶封口。7.2-2.3 震荡洗涤 将三角烧瓶放在往复式震荡器上震荡洗涤 5 m i n,7.2-2.4 离心 立即取下三角烧瓶，将洗涤悬浮液注人经干热灭菌的1 0 m L-2 0 m L刻度离心管内，1 0 0 0 r/m i n离心 3 m i n.7.2-2.5 混合离心 取出离心管，倾去上清液，再加 剩余洗涤悬浮液，混合离心，直至所有洗涤悬浮液离心完毕，留沉淀物。7.2.3 定溶 在沉淀物中加人席尔氏浮载剂使之悬浮，视沉淀物多少定溶至 1 m L-3 mL,7.2.4 制片 用可调微量加样器吸取5 ,L -2 0 p L 沉淀物悬浮液至载玻片上，加盖玻片。制片用沉淀物悬浮液的体积以加盖玻片后悬浮液不外溢为宜。7.2.5 镜检 每份试 验样品的沉淀物悬浮液至少镜检5 张玻片，每片按视野依 次全部 检查。7.2.6 测量 如发现可疑小麦矮化腥黑穗病菌 冬抱子，随机测量3 0 个成 熟冬抱子的网脊高度值。测量应在油镜(1 0 0 x)下进行(见8.1 条)。如测量5 张玻片 后仍不足3 0 个冬 抱子，增加玻片检查数量，直至所有沉淀物悬浮液用毕。7.3 菌瘦检查 如发现腥黑粉菌菌瘦，刮取少许冬抱子粉加适量席尔氏液镜检，作初步鉴定。如怀疑是小麦矮化腥黑穗病菌，按 7.2.6 条对冬抱子进行测量。鉴定方法见第 8 章，结果评定见 9.3 条。8 鉴定方法8.1 冬抱子形态学鉴定方法(见 3.1 条和 7.2.6 条)通过油 镜在监视器屏幕上(或用目 镜测微尺)对每个冬抱子按上下左右随机地测量4 个网脊高度，并求出平均网 脊高度值，用该平 均网脊高度值代表该冬抱 子的网脊高度值进行鉴定。如发现菌澳，还需求出随机测量的3 0 个成熟冬抱子的平均网 脊高度值。8.2 冬抱子自发荧光显微学鉴定方法(见 3.2)发现菌澳时使用本方法。8.2.1 制片 从菌痪上刮取少许冬抱子粉至洁净的载玻片上，加适量蒸馏水制成冬抱子悬浮液(浓度以l o x 1 0 0倍下每视野不超过 4 0 个冬抱子为宜)，置于防尘处任其自然干燥。然后在干燥并附着于载玻片的冬抱子上加一滴无荧光显微镜物镜镜头油，加盖玻片，再加上述镜头油。8.2.2 选择滤光片组 将制好的玻片置于激发滤光片 4 8 5 n m，屏障滤光片5 2 0 n m的落射荧光万能显