GBT 15441-1995 水质 急性毒性的测定 发光细菌法.pdf

中华人民共和国国家标准水质急性毒性的测定发光细菌法GB/T15441-1995Water quality-Determination of the acute toxicity-Luminescent bacteria test1主题内容与适用范围1.1主题内容本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法。1.2适用范围本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测2方法提要基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氟化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC值（半数有效浓度一以样品液百分浓度为单位）来表征。3试剂和材料本标准所用试剂除另有说明外，均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。3.1氯化汞HgC.3.2氯化钠NaCl,化学纯。3.3明亮发光杆菌T,小种(Photobacterium phosphoreum T,spp.)冻千粉，安瓿瓶包装，每瓶0.5g,在25冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细胞：当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2m后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞(5ml测试管)或2万个细胞(2ml测试管)（均为稀释平板法测定）。在毒性测试仪上测出的初始发光量应在6001900mV之间，低于600mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900mV允许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。3.4氯化钠溶液，3g/100ml。氯化钠3g于玻璃容器内，用量筒加蒸馏水100ml.3.5氟化钠溶液，2g/100ml。氯化钠2g,加蒸馏水100ml,于试剂瓶内，25保存。3.6参比毒物氯化汞标准溶液。0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24mg/L。3.7氯化汞母液，p=2000mg/L.万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置2一5冰箱备用，保存期6个月。国家环境保护局1995-03-25批准1995-08-01实施618GB/T15441-19953.8氯化汞工作液，P=2mg/L。用移液管吸氯化汞2000mg/L母液10ml入1000ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml入250ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3g/100ml氯化钠溶液将氯化汞2mg/L溶液按表1稀释成系列浓度（一律采用50ml容量瓶）。这些氯化汞稀释液保存期不超过24h,超过者务必重配表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50ml容量瓶中）如氯化乘(2mg/L)数，ml0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0稀释定容后氯化汞浓度，mg/几0.020.040.060.080.100.120.140.160.180.200.220.244仪器4.1生物发光光度计。配置2或5ml测试管当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过士10%4.22l或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造），分别适用于相应型号的生物发光光度计。4.3微量注射器：10以。4.4注射器：1ml.4.5定量加液瓶：5ml。4.6吸管：2、10、25ml4.7试剂瓶：100ml。4.8量简：100、500ml,4.9棕色容量瓶：50、250、1000ml。4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：10ml,5样品5.1样品的采集和保存a。采样瓶使用带有聚四氯乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥采集水样时，瓶内应充满水样不留空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。b.毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在25下保存样品，但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。.对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定5.2样品液的稀释5.2.1样品液测定前稀释的条件5.2.1.1样品液预试验取事先加氯化钠至3g/100ml浓度的样品母液2ml装入样品管，并设一支CK管（氯化钠3g/100ml溶液），按6所述测定相对发光度。5.2.1.2按5.2.1.1测得的样品，相对发光度低于50%乃至零，欲以EC表达结果，则须稀释5.2.1.3按5.2.1.1测得的样品，相对发光度在1%以上，欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达结果，则不须稀释。5.2.2样品液的稀释液样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100l浓度添加氯化钠或浓溶液(母液只能加固体)。5.2.3样品液稀释浓度的选邦619GB/T15441-19955.2.3.1探测试验按对数系列将样品液稀释成5个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（它们的对数依次为0，-1，-2,-3,-4),按6所述粗测一遍视1%100%相对发光度落在哪一浓度范围。5.2.3.2试验在1%100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配69个浓度（例如，若落在0.1%10%之间，则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1%10%之间，则应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按6所述再测一遍；这69个浓度，也可通过查对数表，按等对数间距原则自行确定（例如，若落在1%10%之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%,它们的对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，对数间距均为0.2)6测定6.1测定条件6.1.1室温室温2025。同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士1。且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的测试室内。6.1.2pH若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。若须测定排除pH影响在内的急性毒性，须将水样和CK(氯化钠3g/100ml)pH测前调至下值：主要含Cu水样为4.5，主要含其他金属水样为5.4，主要含有机化合物水样为7.0。6.1.3溶解氧本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。6.2测定步骤6.2.1试管的排列于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管6.2.1.1按5.2.1.3所述，样品母液相对发光度为1%以上者，如下排列：左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对照(CK)管，后二排放CK预试验管。每管氯化汞或样品液均配一管CK(氯化钠3g/100ml蒸馏水溶液)。设3次重复。每测一批样品，均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液。表2试管在试管架上的排列后二排CK预CK预后一排CK CK CK CK CK CK CKCK CK CK CK CK CK CK前排0.020.020.020.040.040.040.24样1样1样1样2样2样2样管群氯化汞(mg/L)样品6.2.1.2按5.2.1.2所述，样品母液相对发光度为50%以下乃至零者，如下排列：左侧仅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度，它反应15min的相对发光度应在50%左右)，右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同6.2.1.1每测一批样品，均须同时配测氯化汞0.10mg/L溶液。6.2.2加3g/100ml氯化钠溶液用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5ml氯化钠3g/100ml(据仪器型号而定)。6.2.3加样品液620GB/T15441-1995用2或5ml吸管给每支样品管加2或5ml样品液（据6.2.2而定）。每个样品号换一支吸管6.2.4发光细菌冻干菌剂复苏从冰箱25室取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块的小号(11.5L)保温瓶，用1ml注射器吸取0.5.ml冷的氯化钠2g/100ml(适用于5ml测试管)或1ml冷的氯化钠2.5%（适用于2ml测试管）注入已开口的冻干粉安瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。6.2.5仪器的预热和调零打开生物发光光度计电源，预热15min,调零，备用。6.2.6仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量另取一空2或5ml测试管，加2或5ml氯化钠3g/100ml(据6.2.2而定)，加10l复苏发光菌液，盖上瓶塞，用手颠倒5次以达均匀。拔去瓶塞，将该管放入各自型号仪器测试舱内，若发光量立即显示（或经过510min上升到）600mV以上，此瓶冻干粉可用于测试，低于者按3.1.4处理。菌液发光量先缓慢上升，约持续515min,后缓慢下降，约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV,低于者更换冻干粉。6.2.7给各测试管加复苏菌液在发光菌液复苏稳定（约半小时）后，按6.2所述，从左到右，按氯化汞或样品管（前）-CK管（后）一氯化汞或样品管（前）-CK管（后）顺序，用10l微量注射器（勿用定量加液器以减少误差）准确吸取10l复苏菌液，逐一加入各管，盖上瓶塞，用手颠倒5次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min,记作各管反应终止（也即应该读发光量）的时间。6.2.8发光细菌与样品反应达到终止时间的读数按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，在不加瓶塞的情况下，立即将测试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号电压mV数表示）。6.2.9有色样品测定干扰的校正a.拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口；b.取一2ml测试管（直径12mm),加氯化钠3g/100ml溶液2ml,将该管放进一装有少量氯化钠3g/100ml溶液的5ml管（直径20mm)内，要使外管与内管的氯化钠3g/100ml液面平齐。此作CK管：c.另取-2ml测试管，加氯化钠3g/100ml溶液2ml,放入另一装有少量有色待测样品液的5ml管内，要使外管与内管的氯化钠3g/100ml液面平齐。此作CKc管；d.于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10pl(注意：必须是本批样品测定所用同一瓶复苏菌液)，立即记时到秒，等反应满15min,迅即放入仪器测试舱，测定二只带有内管的5ml测试管的发光量。分别记下发光量L1(CK管)和L2(CKc管)；e.计算因颜色引起的发光量(mV)校正值L=L1-L2f.按6.2.7和6.2.8所述常规步骤测试带色样品管及其CK管（氯化钠3g/100ml溶液）的发光量(mV)。所有CK管测得之发光量(mV)均须减去校正值L(mV)后才能作为CK发光量(mV)。621