农业农村部公告第628号-13-2022 转基因生物及其产品食用安全检测 抗营养因子 大豆中凝集素检测方法 液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS65.020.0CCSB04中华人民共禾口国国家标准农业农村部公告第628号3-2022转基因生物及其产品食用安全检测抗营养因子大豆中凝集素检测方法液相色谱串联质谱法FoodsafetydetectionofgeneticalymodifiedorganisnsandderivedproductsDeterminationofanti-nutrientsoybeanagglutininiIlsoybeanbyliquidchroInatographytandemInassspectronetry202229发布2023030实施中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号3-2022口目本文件按照GBT112020标准化二二作导则第l部分;标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共矛国农业农村部提出本文件由全国农业转基因生物安全管则标准化技术委员会归口。本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、中国农业大学、谱尼测试集团股份有限公司本文件主要起草人:黄昆仑、梁晋刚、车会莲、张旭冬、杨柏崇、王军、韩诗受、贺晓云、马丽艳、许文涛、罗云波、农业农村部公告第628号-32022转基因生物及其产品食用安全检测抗营养因子大豆中凝集素检测方法液相色谱串联质谱法范围义么判5.6.2标准工作液B:称取2g五水硫酸铜（CuS（）.5H2（）,溶解在50mL水中。5.7二硫苏糖醇溶液（1moL）:称取0.16g二硫苏糖醇,溶解在1mL水中,现用现配5.8碘乙酚胺溶液（500mmolL）:称取0.093g腆乙酚胺,溶解在1mL水中5.9碳酸氢按溶液（50mmolL）:称取0.04g碳酸氢铰溶解在10mL水中5.0胰蛋白酶（称取0.0lg胰蛋白酶,溶解到mL冰上预冷20min以上的50mmolL碳酸氢按中使用前配制）5.流动相A液:0.1甲酸2乙腊B液:0.1甲酸80乙腊农业农村部公告第628号3202252标准多肋标准曲线分别配制0.05队g队L、1件g队L、5队g队L、10似g队L、20仪g队L合成的定性定量多肋（ALYSTPIHIWI）K）和定性定量复合多肮（NSWDPPNPHIGINVNSIR）标准品溶液并绘制曲线6仪器和设备6.分析天平:感量0.0001g、0.001g利0.0lg6.2.5mL离心管6.3研磨振荡器6.4恒温水浴锅金属干浴。65多功能酶标仪6660目不锈钢筛6.7离心机:转速不低于24000g6.8Cl8固相苹取膜片（Cl8固相苯取小柱）。6,9液相色谱串联质谱仪:配备电喷雾离子源（ESI）6.0冻干仪6.高速粉碎机62高速研磨提取仪7试样制备取干净样品质量大于500g采用对角线分割法,取对角部分缩减至200g将其粉碎通过60目不锈钢筛封后标识明确份做试样份做留样充分混匀,装瓶密封避光备用8测定步骤8蛋白质样品提取准确称取1.00g（精确至0.1g）检测试样加人800似L4SDS溶液加人错珠研磨振荡10min后,95水浴10min置于研磨振荡器中振荡10min24200g、4下离心10min,取上清液200队L用于LCMSMS定量另取100似L上清液用于蛋白质浓度定量82蛋白质提取液定量（BCA法）制备组蛋白质标准品:配制浓度为0尸g队L、0.125似g队L、0.250队g似L、0.500队g队L、0.750件g队L、000队g件L、1.500队g件L的牛清白蛋白标准品溶液。取25队L标准品及待测样品于微孔板中每孔中加人200队LBSA工作试剂在微孔板振荡器上混合30s后,于37孵育30mln。冷却至室温后在多功能酶标仪上测量562nm处的汲光度。以标准品浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制线性标准线图再依据测定的吸光值计算大豆样品中蛋白质浓度83蛋白质还原烷基化与沉淀川人2件L1molL二硫苏糖醇溶液储备液至200仪L蛋白质提取液中55恒温水浴锅中反应40min;川20队L500mmolL碘乙酚胺溶液避光反应30min;用900似L20预冷的丙酮沉淀置于-20过夜24200g离心20mm,小心吸取并弃去上清液;用800队L80丙酮洗涤沉淀20静置30mln,24200g离心小心吸取并弃去上清液;再用800队L80预冷丙酮洗涤沉淀;小心吸取并弃去上清液通风橱中静置15min;待丙酮挥发用150件L50mmolLNH3HCO3重悬蛋白质以8.2所测得蛋白质浓度乘样品体积计算出蛋白质总量按照1:50的酶和蛋白质质量比例加人胰蛋白酶进行酶解用醋酸或者氨水调节pH至8左右补足体积至190队L,置于37恒温水浴锅中进行酶解反应过夜。酶解后的溶液样品,加10队L10甲酸溶液,置于4冰箱静置30mm24200g离心30min后,吸取150似L,置于液相进样小瓶中待测2农业农村部公告第628号-320228.4测定8.4.色谱条件a）色谱柱:C8色谱柱（4.6mm50mm,3。5尸m,130A）,或性能相当者;b）柱温:50.C;c）流动相:流动相A:0.1甲酸,水;流动相B:0.1甲酸80乙青;d）流速:200队Lmin;e）进样体积;10队L;）梯度洗脱程序见表1表梯度洗脱程序B相,A相,967020209696时间min0lll533.55即即8.4,2a）b）C）d）e）质谱参考条件离子源:电喷雾离子源;电离方式:正离子模式;检测方式:平行离子扫描（PRM）;喷雾电压、碰撞能量、离子源温度等参数优化至最优灵敏度;脱溶剂气、碰撞气为高纯氮气或者其他合适气体;定性定量离子设定见表2.表2质谱定性定量离子设定碰撞能问!303030272727离子对652。3888.5（定量离子对）6523775.4（定性离子对）652.3416。2（定性离子对）677.3764,4（定最离子对）677.3503。（定性离子对）677.33881（定性离子对）多肋定性定遗多肤（标准肋一）（氨擎酸序列:TSNILSDVVDLI）定件定斌复核多肤（标准肤二）（氨雌酸序列:NSWI）PPNPHIGINVNSIR）8.43定性定量方法84.3.定性测定利用标准肋一和标准肤二的保留时间和二级谱图（或者子离子）进行定性。其中标准肋作为本标准的定性与定量分子,标准肤二作为本标准的定性与定量复核分子样品与标准品保留时间的相对偏差不大于05样品的3个特征离子基峰百分数与标准品允许差分别为:当基峰百分数50时,允许差20;当基峰百分数2050时,允许差25;当基峰百分数1020时,允许差30;当基孽百分数10时,允许差50。8.32定量测定用标讹肋一的离子对（652.3888.5）条面积进行标准线外标法定量（记为X队gL）9结果的计算与表述试样中大豆凝集索含量按公式（1）计算。R（30927.991303.47）X0.8（1）3农业农村部公告第628号3-2022R大豆凝集素含量的数值,以质量分数计,单位为克每千克（gkg）;X从标准线上得到的被测组分溶液质量浓度的数值,单位为毫克每毫升（mgmL）;试样质虽的数值,单位为千克（kg）注:大豆凝集索的分子址为3092799;注2:多肤的分子茧为1303.47;注3:大豆提取后的体积为0.8mL。0精密度在重复其他条件下获得的2次独立测定结军栖v斗差值不得超过算术平均值的l5本方法大仁司刮臼巴禹珊们刮昂蒋悍当悍G中华人民共和阀国家标准转基因生物及其产品食用安全检测抗营养因子大豆中凝集素检测方法液相色谱串联质谱法农业农村部公告第628号13-2022扑兴兴中到农业出版社出版（b京市朝阳x龚子店街18号楼）（!政编码:100125网址:）北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销并并升开本880mm1230mm116印张0。75宁数15千字2023年2月第1版2023年2月北京第1次印刷书号:161099336定价:24.00元尸版权专有侵权必究举报电话:（00）599426农业农村部公告第628号-S-2022